La co-inmunoprecipitación (Co-IP) es el método más utilizado para detectar e identificar interacciones proteína-proteína en condiciones nativas. Utiliza un anticuerpo específico para capturar una proteína cebo y cualquier proteína unida a ella a partir de un lisado celular.

Principio

Un anticuerpo contra la proteína diana (cebo) se inmoviliza en un soporte sólido — típicamente perlas de agarosa con Proteína A/G o perlas magnéticas. Cuando las perlas conjugadas con anticuerpo se incuban con un lisado celular o tisular, la proteína cebo es capturada junto con cualquier proteína que esté físicamente asociada a ella. Después de lavar el material no unido, las proteínas unidas se eluyen y se analizan mediante Western blot o espectrometría de masas.

Resumen del Protocolo

1. Prepare el lisado usando un tampón de lisis suave y no desnaturalizante que preserve las interacciones proteicas (ej., Tris 50 mM pH 7.5, NaCl 150 mM, NP-40 al 1%, inhibidores de proteasa). Mantenga las muestras en hielo.
2. Pre-clarifique el lisado incubando con perlas vacías (sin anticuerpo) para eliminar proteínas que se unen no específicamente a la superficie de las perlas.
3. Incube el lisado pre-clarificado con las perlas conjugadas con anticuerpo a 4 °C durante 1–4 horas (o toda la noche) con rotación suave.
4. Lave las perlas 3–5 veces con tampón de lisis frío. La rigurosidad puede aumentarse elevando la concentración de sal (NaCl 250–500 mM) o añadiendo un detergente suave (Tween-20 al 0.1%).
5. Eluya las proteínas unidas con tampón de muestra para SDS-PAGE y calor (5 minutos a 95 °C).
6. Analice mediante Western blot (para interactores conocidos) o espectrometría de masas (para descubrimiento).

Controles

Los controles rigurosos son esenciales:

• Control de isotipo: use un anticuerpo no específico del mismo isotipo para distinguir la unión específica del fondo.
• Control solo con perlas: perlas sin anticuerpo para identificar proteínas que se unen a la matriz de perlas.
• Control de silenciamiento/eliminación: lisado de células que carecen de la proteína cebo para demostrar la especificidad del anticuerpo.
• Co-IP inversa: realice la IP recíproca usando un anticuerpo contra el presunto interactor.

Entrecruzamiento

Los propios anticuerpos se co-eluyen con la diana y pueden interferir con la espectrometría de masas. El entrecruzamiento del anticuerpo a las perlas (usando DSS o BS³) antes de la incubación evita la elución del anticuerpo. Un control con perlas entrecruzadas debe confirmar que el anticuerpo sigue siendo funcional después del entrecruzamiento.

Variantes

• Co-IP nativa: usa tampón de lisis no desnaturalizante. Preserva los complejos nativos pero puede co-precipitar proteínas asociadas indirectamente.
• Co-IP con entrecruzamiento: un agente de entrecruzamiento reversible (ej., formaldehído, DSP) estabiliza interacciones débiles o transitorias antes de la lisis.
• Co-IP nuclear: para complejos de factores de transcripción, use un protocolo de extracción nuclear e incluya DNasa I para liberar proteínas unidas a cromatina.