Reaksi berantai polimerase (PCR) telah menghasilkan banyak varian dan aplikasi khusus yang memperluas kegunaannya di luar amplifikasi DNA sederhana. Teknik ini memungkinkan deteksi mutasi, analisis metilasi, diagnostik molekuler, dan identifikasi forensik.
PCR Alel-Spesifik
PCR alel-spesifik membedakan sekuens DNA yang berbeda oleh satu nukleotida. Metode ini menggunakan primer dengan basa terminal 3-prime yang diposisikan di situs polimorfik. Ketika basa terminal cocok dengan templat, amplifikasi berlangsung efisien. Ketika tidak cocok, ekstensi diblokir atau sangat berkurang. Dengan menggunakan dua primer spesifik untuk setiap alel dalam reaksi terpisah, genotip dapat ditentukan. Teknik ini banyak digunakan untuk genotip polimorfisme nukleotida tunggal dan mendeteksi mutasi terkait penyakit seperti faktor V Leiden dan protrombin G20210A.
PCR Spesifik Metilasi
PCR spesifik metilasi mendeteksi pola metilasi DNA, yang merupakan tanda epigenetik penting dalam kanker dan perkembangan. DNA genom diolah dengan natrium bisulfit, yang mengubah sitosin yang tidak termetilasi menjadi urasil sementara meninggalkan sitosin termetilasi tidak berubah. PCR dengan primer yang dirancang untuk membedakan sekuens yang telah diubah dan tidak diubah kemudian menentukan status metilasi situs CpG. Teknik ini digunakan untuk mendeteksi metilasi promotor abnormal pada gen penekan tumor dan untuk analisis pencetakan.
PCR Invers
PCR invers mengamplifikasi daerah DNA yang mengapit sekuens yang diketahui, berguna untuk mengidentifikasi situs insersi atau mengkarakterisasi daerah sisi luar yang tidak diketahui. DNA genom dicerna dengan enzim restriksi yang memotong di luar daerah yang diketahui, dan fragmen disirkularkan dengan ligasi. PCR dengan primer yang berorientasi ke luar dari sekuens yang diketahui kemudian mengamplifikasi DNA sisi luar yang tidak diketahui melintasi sambungan ligasi. PCR invers telah digunakan untuk mengkarakterisasi situs insersi transposon dan situs integrasi virus dalam genom.
PCR Degeneratif
PCR degeneratif menggunakan kumpulan primer yang mengandung basa campuran pada posisi tertentu untuk mengamplifikasi gen terkait dari spesies yang berbeda atau anggota famili gen. Primer dirancang dari sekuens asam amino yang dikonservasi, dengan degenerasi diperkenalkan pada posisi goyah kodon. Teknik ini digunakan untuk mengkloning gen homolog dari spesies baru, mengidentifikasi anggota famili gen, dan mendeteksi patogen dengan sekuens variabel. PCR touchdown, di mana suhu anil diturunkan secara progresif, meningkatkan spesifisitas dalam PCR degeneratif.
Aplikasi PCR Kuantitatif
PCR kuantitatif (qPCR) melampaui pengukuran ekspresi gen. Analisis variasi jumlah salinan menggunakan qPCR untuk mendeteksi delesi atau amplifikasi gen dengan membandingkan amplifikasi gen target dengan gen referensi. Teknik ini digunakan dalam pengujian HER2 untuk kanker payudara dan untuk mendeteksi kelainan kromosom. Deteksi patogen menggunakan qPCR untuk mengukur beban virus pada pasien HIV, hepatitis B, dan hepatitis C, memandu keputusan pengobatan. Deteksi GMO mengkuantifikasi jumlah bahan yang dimodifikasi secara genetik dalam produk makanan.
Aplikasi PCR Digital
PCR digital memberikan kuantifikasi absolut tanpa kurva standar. Ini digunakan untuk mendeteksi mutasi langka dalam DNA tumor yang bersirkulasi, memungkinkan biopsi cair untuk pemantauan kanker. PCR digital juga mendeteksi penyakit sisa setelah pengobatan, mengidentifikasi aneuploidi janin dari darah ibu, dan mengkarakterisasi variasi jumlah salinan dengan presisi tinggi. Sensitivitas tinggi PCR digital memungkinkan deteksi alel mutan yang ada pada frekuensi di bawah 0,1%.
PCR Forensik
Analisis pengulangan tandem pendek menggunakan PCR multipleks adalah metode standar untuk identifikasi manusia dalam forensik. Kit komersial mengamplifikasi 15 hingga 20 lokus STR ditambah penanda penentu jenis kelamin amelogenin dalam satu reaksi. Fragmen yang diamplifikasi dipisahkan oleh elektroforesis kapiler, dan ukuran alel ditentukan. Probabilitas dua individu yang tidak terkait berbagi profil STR yang sama biasanya kurang dari satu dalam satu miliar. Analisis DNA sentuhan memungkinkan pembuatan profil dari sampel kecil yang hanya mengandung beberapa sel.
PCR Sel Tunggal
PCR sel tunggal mengamplifikasi genom atau transkriptom sel individu, mengungkapkan heterogenitas yang tersembunyi dalam analisis massal. Teknik ini dimulai dengan isolasi sel melalui mikromanipulasi, pemilahan aliran, atau mikrofluida. Amplifikasi seluruh genom menggunakan amplifikasi perpindahan berganda atau metode berbasis PCR meningkatkan jumlah DNA untuk analisis hilir. Pengurutan RNA sel tunggal menggunakan transkripsi balik dan amplifikasi PCR untuk memprofilkan ekspresi gen dalam sel individu, mengungkapkan jenis sel, keadaan, dan lintasan perkembangan.
