Kuantifikasi protein adalah proses menentukan konsentrasi protein dalam suatu larutan. Kuantifikasi protein yang akurat sangat penting untuk banyak aplikasi hilir, termasuk SDS-PAGE, Western blotting, enzyme assays, dan studi struktural.
Metode Kuantifikasi Protein Umum
Uji Bradford
Uji Bradford didasarkan pada pengikatan pewarna Coomassie Brilliant Blue G-250 dengan protein. Pewarna berubah dari coklat menjadi biru ketika terikat pada protein, dengan serapan maksimum berubah dari 465 nm menjadi 595 nm. Pengujiannya cepat, sederhana, dan kompatibel dengan sebagian besar buffer. Kurang akurat jika terdapat deterjen.
Uji BCA
Uji asam bicinchoninic (BCA) bergantung pada reduksi Cu2+ menjadi Cu1+ oleh protein dalam media basa. BCA kemudian mengkelat Cu1+, membentuk warna ungu yang menyerap pada 562 nm. Uji BCA lebih toleran terhadap deterjen dibandingkan uji Bradford namun kurang kompatibel dengan zat pereduksi.
Uji Lowry
Uji Lowry menggabungkan reaksi biuret (khelasi tembaga) dengan reagen Folin-Ciocalteu, yang bereaksi dengan residu tirosin dan triptofan. Ini menghasilkan warna biru diukur pada 750 nm. Ini sensitif tetapi memerlukan waktu yang cermat dan dipengaruhi oleh banyak zat yang mengganggu.
Penyerapan UV (A280)
Protein menyerap sinar UV pada 280 nm karena residu triptofan dan tirosin. Absorbansi pada 280 nm memberikan perkiraan konsentrasi protein yang cepat dan tidak merusak. Ini paling akurat untuk protein murni dengan koefisien kepunahan yang diketahui.
Kurva Standar
Semua pengujian kolorimetri memerlukan kurva standar. Pengenceran serial standar protein yang diketahui, biasanya albumin serum sapi (BSA), disiapkan dan diukur. Absorbansi sampel yang tidak diketahui dibandingkan dengan kurva standar untuk menghitung konsentrasinya.
Protokol Uji BCA dan Bradford yang Praktis
Uji BCA: Siapkan standar BSA dengan pengenceran serial dalam buffer yang sama dengan sampel — kisaran umumnya adalah 25–2000 µg/mL (0, 25, 125, 250, 500, 750, 1000, 1500, 2000 µg/mL). Campurkan 25 µL setiap standar atau sampel dengan 200 µL reagen kerja BCA (perbandingan reagen A dan reagen B 50:1) dalam pelat 96 lubang. Inkubasi pada suhu 37°C selama 30 menit. Dinginkan hingga suhu kamar dan ukur serapannya pada 562 nm. Cocokkan kurva standar kuadrat atau linier. Uji BCA kompatibel dengan deterjen (SDS, Triton X-100) hingga 5% namun tidak kompatibel dengan zat pereduksi (DTT, β-mercaptoetanol) > 1 mM. Uji Bradford: Siapkan standar dalam kisaran yang sama (25–1000 µg/mL). Campurkan 10 µL standar atau sampel dengan 200 µL reagen Bradford (pewarna Coomassie G-250 dalam asam fosfat dan metanol). Inkubasi pada suhu kamar selama 5 menit. Ukur serapan pada 595 nm. Uji Bradford cepat (2 menit) dan kompatibel dengan zat pereduksi dan zat pengkelat (EDTA) namun sangat dihambat oleh deterjen (>0,1% Triton X-100 atau SDS). Untuk kedua pengujian, sertakan blanko dengan buffer saja. Setiap standar dan sampel harus diuji dalam rangkap dua atau rangkap tiga. Buang pembacaan dengan CV > 15%. Pecahkan masalah latar belakang tinggi dengan mengencerkan sampel lebih lanjut, mengganti pengujian (gunakan Bradford jika sampel mengandung zat pereduksi, gunakan BCA jika sampel mengandung deterjen), atau melakukan pengendapan TCA/aseton untuk menghilangkan zat yang mengganggu.
Aplikasi Dunia Nyata
Saat mengukur protein lisat dari sel mamalia yang diekstraksi dalam buffer RIPA (mengandung 1% Triton X-100 dan 0,1% SDS), uji BCA lebih disukai daripada Bradford. Kurva standar dari 25–2000 µg/mL BSA dalam buffer RIPA menunjukkan R² = 0,996. Lisat yang tidak diketahui menghasilkan A562 = 0,45, setara dengan 1250 µg/mL. Setelah pengenceran, 20 µg dimasukkan per jalur untuk SDS-PAGE atau untuk analisis dengan elektroforesis gel kapiler.
