Ikhtisar
Proteomik kuantitatif bertujuan untuk mengukur perubahan kelimpahan protein pada berbagai kondisi biologis. Tidak seperti identifikasi kualitatif, yang hanya menentukan keberadaan protein, kuantifikasi mengungkapkan bagaimana proteom merespons rangsangan, penyakit, atau pengobatan. Dua strategi umum mendominasi bidang ini: metode berbasis label yang memperkenalkan tag isotop stabil ke dalam protein atau peptida, dan metode bebas label yang menyimpulkan kelimpahan dari jumlah spektral atau intensitas ion. Setiap pendekatan membawa trade-off antara akurasi, kapasitas multiplexing, biaya, dan kompleksitas eksperimental, sehingga pilihan metode sangat bergantung pada pertanyaan biologis yang diajukan.
Metode
Teknik pelabelan isotop stabil mencakup SILAC (pelabelan metabolik dalam kultur sel), TMT dan iTRAQ (tag isobarik untuk kuantifikasi relatif dan absolut), dan pelabelan dimetil. Hal ini memperkenalkan pergeseran massa tertentu yang dapat dibedakan oleh spektrometer massa, sehingga memungkinkan analisis multipleks hingga 16 sampel dalam sekali proses. Kuantifikasi bebas label menggunakan jumlah spektrum yang teridentifikasi (penghitungan spektral) atau area kromatogram ion yang diekstraksi dari setiap peptida (intensitas MS1). Metode akuisisi data-independen (DIA) seperti SWATH-MS menggabungkan cakupan proteom yang dalam dengan presisi kuantitatif di seluruh kelompok sampel yang besar.
Protokol Praktis
Eksperimen proteomik kuantitatif berbasis SILAC dimulai dengan pelabelan metabolik. Sel dikultur dalam media “ringan” (Arg-0, Lys-0) atau “berat” (Arg-10, Lys-8) untuk setidaknya lima penggandaan sel untuk mencapai penggabungan lengkap. Sel ringan dan berat tunduk pada kondisi yang berbeda - misalnya, perlakuan inhibitor versus kontrol kendaraan. Setelah lisis, protein digabungkan dalam perbandingan 1:1 berdasarkan konsentrasi protein total, dicerna dengan trypsin, dan difraksinasi dengan HPLC fase balik dasar menjadi 12-24 fraksi. Setiap fraksi dianalisis dengan LC-MS/MS pada spektrometer massa resolusi tinggi. Instrumen mendeteksi pasangan puncak peptida yang dipisahkan oleh pergeseran massa yang disebabkan oleh label berat. Kuantifikasi terjadi pada tingkat MS1: perangkat lunak mengekstrak kromatogram ion untuk setiap pasangan peptida dan menghitung rasio berat terhadap ringan. MaxQuant memproses file mentah dan rasio protein yang dihasilkan dinormalisasi dengan memusatkan rasio median log2 ke nol, mengoreksi kesalahan pencampuran kecil. Uji-t dua sampel atau ANOVA dengan koreksi Benjamini-Hochberg mengidentifikasi perubahan protein secara signifikan. Untuk eksperimen berbasis TMT, pelabelan terjadi pada tingkat peptida setelah pencernaan, dan kuantifikasi menggunakan intensitas ion reporter dalam spektrum MS/MS, memungkinkan perbandingan multipleks hingga 16 sampel secara bersamaan. Dalam penerapannya yang penting, proteomik kuantitatif berbasis TMT mengkuantifikasi 10.000 protein di 10 lini sel kanker payudara, mengungkapkan regulasi jalur metabolisme terkoordinasi yang terkait dengan sinyal onkogenik. SILAC telah digunakan untuk membuat profil respons tirosin fosfoproteom terhadap pengobatan imatinib pada sel leukemia myeloid kronis, mengidentifikasi keterlibatan target dan mekanisme resistensi obat.
Aplikasi
Proteomik kuantitatif diterapkan secara luas dalam penemuan biomarker, membandingkan kadar protein antara jaringan sehat dan sakit untuk mengidentifikasi tanda diagnostik atau prognostik. Dalam pengembangan obat, hal ini membuat profil keterlibatan target dan efek di luar target. Integrasi data kuantitatif dengan validasi ELISA dan Western blot memastikan ketahanan. Metode seperti kuantifikasi berbasis spektrometri massa melengkapi pendekatan berbasis gel tradisional seperti SDS-PAGE dan elektroforesis gel kapiler (CGE), sehingga memberikan cakupan yang lebih dalam dan throughput yang lebih tinggi.
