Ikhtisar
BLAST (Basic Local Alignment Search Tool) adalah algoritma yang paling banyak digunakan untuk membandingkan urutan kueri dengan database urutan yang diketahui. Teknologi ini dengan cepat mengidentifikasi keselarasan lokal yang signifikan secara statistik, memberikan anotasi fungsional untuk gen-gen baru, mendeteksi homologi antar spesies yang berjauhan, dan mengungkap hubungan evolusioner. BLAST mengorbankan jaminan optimalitas pemrograman dinamis penuh untuk heuristik yang cukup cepat untuk mencari database yang berisi miliaran residu. Signifikansi statistik dari setiap pukulan dilaporkan sebagai nilai-E, jumlah peluang yang diharapkan untuk selaras dengan skor tertentu dalam database sebesar itu.
Konsep Utama
BLAST bekerja dengan terlebih dahulu memecah kueri menjadi kata-kata pendek (biasanya 3 untuk protein, 11 untuk nukleotida), memindai database untuk mencari kecocokan persis dengan kata-kata tersebut, dan kemudian memperluas kecocokan yang menjanjikan di kedua arah untuk membangun keselarasan yang lebih panjang. Varian menangani kasus penggunaan spesifik: BLASTP membandingkan kueri protein dengan database protein, BLASTN membandingkan kueri nukleotida dengan database nukleotida, BLASTX menerjemahkan kueri nukleotida di keenam kerangka pembacaan untuk perbandingan tingkat protein, dan PSI-BLAST secara berulang membuat matriks skor spesifik posisi untuk mendeteksi homolog jauh. MegabLAST dioptimalkan untuk rangkaian yang sangat mirip, sedangkan MegabLAST yang tidak bersebelahan menangani perbandingan lintas spesies.
Aplikasi
BLAST adalah langkah pertama dalam memberi anotasi yang tidak diketahui dari proyek pengurutan DNA. Ini memberikan fungsi yang diduga pada protein baru dengan mendeteksi homologi pada [struktur protein] yang dikarakterisasi (/id/guides/protein-structure.html). Dalam genetika bakteri, BLAST mengidentifikasi faktor virulensi dan gen resistensi antibiotik. Teknologi DNA rekombinan menggunakan BLAST untuk memverifikasi integritas konstruksi dengan menyelaraskan pembacaan urutan terhadap urutan vektor yang diharapkan.
Protokol Praktis
Pencarian BLAST standar dijalankan melalui antarmuka web NCBI atau baris perintah. Untuk kueri protein terhadap database nr menggunakan baris perintah BLAST: blastp -query query.fasta -db nr -out results.txt -evalue 1e-5 -num_threads 8 -outfmt "6 qseqid sseqid pident length mismatch gapopen qstart qend sstart send evalue bitscore stitle". -outfmt 6 menghasilkan keluaran tabel yang ideal untuk penguraian hilir. Nilai-E (nilai ekspektasi) mewakili jumlah serangan yang diharapkan secara kebetulan pada skor tertentu berdasarkan ukuran database, nilai < 1 × 10⁻⁵ untuk protein atau < 1 × 10⁻¹⁰ untuk nukleotida menunjukkan homologi yang signifikan. skor bit adalah skor yang dinormalisasi, tidak bergantung pada ukuran database, sehingga memungkinkan perbandingan antar penelusuran; skor di atas 50 biasanya berarti untuk protein. Untuk penelusuran yang diterjemahkan (kueri nukleotida terhadap basis data protein), gunakan BLASTX: blastx -query ests.fasta -db swissprot -out blastx_results.txt -evalue 1e-5. Untuk urutan yang sangat mirip, gunakan MegabLAST: blastn -task megablast -query query.fna -db nt -out megablast_results.txt -evalue 1e-50. Optimalkan parameter: kurangi ukuran kata menjadi 2 (untuk protein) atau 7 (untuk nukleotida) untuk meningkatkan sensitivitas homolog jauh; meningkatkan ambang batas untuk memperluas jangkauan benih. Untuk pencarian profil berulang, jalankan PSI-BLAST: psiblast -query seed.fasta -db nr -out psi_results.txt -num_iterations 3 -evalue 1e-3. PSI-BLAST membuat matriks penilaian posisi spesifik (PSSM) dari pukulan putaran pertama dan menggunakannya untuk putaran berikutnya, mendeteksi homolog jarak jauh yang tidak dilewatkan oleh BLAST standar. Untuk penelusuran batch skala besar, gunakan diamond yang 100–1000× lebih cepat dari BLASTP: diamond blastp -d nr.dmnd -q query.fasta -o diamond_results.txt --outfmt 6 --evalue 1e-5 --threads 16.
