CpG二核苷酸上的DNA甲基化是特征最明确的表观遗传修饰。亚硫酸氢盐转化结合测序提供了这种标记的全基因组定量读数。

亚硫酸氢盐化学

用亚硫酸氢钠（NaHSO₃）在低pH（pH 5.0、50–70 °C、4–16小时）下处理基因组DNA，将未甲基化的胞嘧啶脱氨基为尿嘧啶，而5-甲基胞嘧啶（5mC）和5-羟甲基胞嘧啶（5hmC）对脱氨基具有抗性。PCR扩增后，尿嘧啶被读作胸腺嘧啶，5mC被读作胞嘧啶。

转化率应>99%方可可靠。通常使用未转化的λ噬菌体DNA作为掺入对照来测量转化效率。

方法

全基因组亚硫酸氢盐测序（WGBS）：亚硫酸氢盐转化后对整个基因组进行测序。这是在单碱基分辨率下对整个基因组进行全面甲基化分析的黄金标准。计算成本高：人类基因组的30×覆盖度需要约9亿个读段。由于亚硫酸氢盐转化的DNA主要是C→T（互补链上是G→A），比对需要专门的三个字母基因组索引（两条链均进行C→T转化）。

简化代表性亚硫酸氢盐测序（RRBS）：首先用甲基化不敏感的限制性内切酶（MspI，C↓CGG）消化基因组DNA，该酶在CpG丰富区域切割。选择40–220 bp的片段，进行亚硫酸氢盐转化和测序。RRBS富集CpG岛、启动子和其他调控区域，成本约为WGBS的10–20%。

靶向亚硫酸氢盐测序：设计PCR引物，从亚硫酸氢盐转化的DNA中扩增特定的感兴趣区域。PCR产物通过Sanger测序或NGS测序。覆盖数百个区域的靶向多重检测板可商业获取。这种方法对于专注于特定基因面板的项目具有成本效益。

焦磷酸测序：一种从亚硫酸氢盐转化DNA的短扩增子（100–200 bp）进行定量实时测序的方法。每个C位置的峰高反映C（甲基化）与T（未甲基化）的比例，给出每个CpG位点的定量甲基化百分比。焦磷酸测序是验证通过芯片或NGS鉴定的甲基化标记的黄金标准。

数据分析

每个CpG位点的甲基化报告为β值：β = M / (M + U + 100)，其中M是甲基化读段数，U是非甲基化读段数。β值范围从0（完全未甲基化）到1（完全甲基化）。

差异甲基化分析识别不同条件之间的差异甲基化位点（DMP）和区域（DMR）。大多数方法使用β-二项式模型来考虑CpG位点上覆盖度的可变性。

区分5mC和5hmC

标准亚硫酸氢盐测序无法区分5-甲基胞嘧啶和5-羟甲基胞嘧啶，两者都受到保护免于脱氨基。要特异性地检测5hmC，需要额外的方法：

• TAB-Seq：T4-β-葡萄糖基转移酶用葡萄糖保护5hmC，然后TET1将5mC氧化为5caC，再通过亚硫酸氢盐转化为尿嘧啶。只有5hmC读作C。
• oxBS-Seq：高钌酸钾（KRuO₄）将5hmC氧化为5fC，通过亚硫酸氢盐转化为尿嘧啶。5mC保持为C。通过将oxBS-Seq与标准BS-Seq进行比较，通过减法获得5hmC水平。