免疫共沉淀是在天然条件下检测和鉴定蛋白质-蛋白质相互作用最广泛使用的方法。它使用特异性抗体从细胞裂解液中捕获诱饵蛋白及其结合的任何蛋白质。

原理

针对目标（诱饵）蛋白的抗体被固定在固相支持物上——通常是 Protein A/G 琼脂糖珠或磁珠。当抗体偶联的珠子与细胞或组织裂解液孵育时，诱饵蛋白连同与其物理结合的任何蛋白质一起被捕获。洗去未结合的物质后，洗脱结合蛋白并通过 Western blot 或质谱分析。

操作概述

1. 使用温和的非变性裂解缓冲液制备裂解液。样品保持在冰上。
2. 通过与空白珠子（无抗体）孵育预清除裂解液，去除非特异性结合到珠子表面的蛋白质。
3. 将预清除的裂解液与抗体偶联珠子在 4 °C 下孵育 1–4 小时，温和旋转。
4. 用冷裂解缓冲液洗涤珠子 3–5 次。可通过提高盐浓度或添加温和去垢剂增加严格性。
5. 用 SDS-PAGE 样品缓冲液洗脱结合蛋白并加热。
6. 通过 Western blot 或质谱分析。

对照

严格的对照至关重要：

• 同型对照：使用相同同型的非特异性抗体区分特异性结合与背景。
• 仅珠子对照：无抗体的珠子以识别结合到珠子基质上的蛋白质。
• 敲低/敲除对照：缺乏诱饵蛋白的细胞裂解液证明抗体特异性。
• 反向 Co-IP：使用针对可疑相互作用物的抗体进行反向 IP。

交联

抗体本身会与靶标共洗脱并干扰质谱分析。孵育前将抗体交联到珠子上可防止抗体洗脱。必须使用交联珠子的对照确认抗体在交联后仍有功能。

变体

• 天然 Co-IP：使用非变性裂解缓冲液。保留天然复合物，但可能共沉淀间接相关的蛋白质。
• 交联 Co-IP：可逆交联剂在裂解前稳定弱或瞬时相互作用。
• 核 Co-IP：对于转录因子复合物，使用核提取方案并包含 DNase I 以释放染色质结合蛋白。