EMSA 和 DNA 足迹分析是研究蛋白质-DNA 相互作用的经典方法。 EMSA 检测结合并测量亲和力，而足迹法则识别结合蛋白接触的特定核苷酸。

电泳迁移率变化测定

EMSA，也称为凝胶位移测定，基于这样的观察：蛋白质-DNA 复合物在天然聚丙烯酰胺凝胶中的迁移速度比游离 DNA 慢，类似于[[琼脂糖凝胶](/guides/agarose-gel-electrophoresis.html)电泳](/guides/agarose-gel- electrophoresis.html)。将含有推定结合位点的放射性标记或荧光标记的 DNA 探针与蛋白质提取物或纯化的蛋白质一起孵育。通过非变性凝胶电泳分离混合物。游离 DNA 运行得更快，而蛋白质结合的 DNA 则转移到凝胶中更高的位置。

EMSA 具有高灵敏度，可以检测复杂混合物中的相互作用。特异性通过与未标记的特异性和非特异性 DNA 的竞争来证明。过量的未标记特异性 DNA 会消除移位的条带，而非特异性竞争物则不会。 Supershift 测定使用针对结合蛋白的抗体来进一步延迟复合物，从而确认蛋白质身份。

结合亲和力和化学计量

EMSA 可以通过滴定蛋白质浓度和定量结合 DNA 的分数来测量结合亲和力。平衡解离常数由半最大结合时的蛋白质浓度确定。多个移动带可以揭示不同的化学计量复合物或多个结合位点。当结合曲线呈 S 形而不是双曲线时，即可检测到协同结合。

探针设计

用于 EMSA 的 DNA 探针通常包含 20 至 40 个碱基对，包含结合位点。双链探针是通过将互补寡核苷酸退火并用放射性磷 32 或荧光染料进行末端标记来制备的。数百个碱基对的较长探针可用于绘制顺式调控区域。 Southern blot 中使用的具有化学发光检测功能的生物素标记探针提供了一种非放射性替代方案。

DNase I 足迹

DNase I 足迹识别受结合蛋白保护的特定核苷酸。将一端标记的 DNA 片段与结合蛋白一起孵育，然后用 DNase I 进行部分消化。核酸酶随机切割未受保护的 DNA，但蛋白质结合区域受到保护而不会被切割。消化产物通过变性凝胶电泳沿着测序阶梯进行分离。

保护图案表现为带梯中的间隙，即足迹。足迹的边界定义了核苷酸分辨率下的蛋白质结合位点。 DNase I 切割更频繁的超敏感位点通常出现在足迹的边缘，表明蛋白质结合引起的 DNA 弯曲。

羟基自由基足迹

羟基自由基足迹法使用高反应性羟基自由基在每个位置切割 DNA 主链，几乎没有序列偏差。使用铁-EDTA、抗坏血酸盐和过氧化氢通过芬顿反应产生自由基。由于自由基比 DNase I 小，羟基自由基足迹法可提供更高的分辨率，检测单个核苷酸表面上的接触。它对于分析沿着 DNA 螺旋的蛋白质-DNA 相互作用的周期性特别有用。

体内方法

体内足迹法使用修饰活细胞中 DNA 的试剂。硫酸二甲酯将不受结合蛋白保护的鸟嘌呤残基甲基化。处理后，分离 DNA，在甲基化位点进行切割，并通过连接介导的 PCR 进行分析。体内和体外模式的比较揭示了细胞中哪些结合位点被占据。 DNase-seq 和 ATAC-seq 等染色质可及性测定可提供开放染色质的全基因组视图，但分辨率低于足迹法。

应用程序

EMSA 用于确认预测的转录因子结合位点、表征突变体结合位点、研究协同相互作用以及监测纯化过程中的结合活性。足迹法可识别蛋白质识别的确切 DNA 序列，并揭示结合引起的构象变化。

限制

EMSA 需要能够耐受电泳的相对稳定的复合物。可能无法检测到快速解离的复合物。凝胶基质可以稳定弱相互作用，但也会因笼蔽效应而产生伪影。这两种技术都需要纯化的 DNA 探针，不适合高通量分析。定量 EMSA 需要仔细控制探针比活性和检测线性。