固定是组织保存的第一步，也是最关键的一步。它可以阻止细胞腐烂、稳定大分子并硬化组织以进行后续的处理和切片。每项下游技术（H&E 染色、IHC、分子分析）的质量都取决于充分且适当的固定。

固定目标

固定的主要目标是防止自溶（细胞内酶的自身消化）和腐败（细菌分解）；保持组织形态尽可能接近活体状态；使组织硬化，以便切割时不变形；稳定细胞成分（蛋白质、核酸、碳水化合物）以进行染色；并使细胞可渗透染料和抗体。没有一种固定剂可以最佳地实现所有目标，选择取决于预期的下游应用。

福尔马林化学

10% 中性缓冲福尔马林 (NBF) 是组织病理学中的通用固定剂。商业福尔马林是 37% 的甲醛气体水溶液 - 10% NBF 是 1:10 的稀释液（3.7% 甲醛）。中性缓冲液（磷酸二氢钠和磷酸二氢钠，pH 7.0-7.2）可防止甲酸（导致酸性血红素色素）的形成并保持最佳的交联条件。

甲醛通过在相邻氨基之间形成亚甲基桥 (-CH2-) 来交联蛋白质，特别是赖氨酸的ε-氨基和肽的酰胺基团。这创建了一个稳定组织结构的三维凝胶网络。交联与温度有关 - 37°C 下的交联速度大约是室温下的两倍。小活检在室温下的常规固定需要 6-24 小时，较大样本需要 24-48 小时。标准规则是每毫米组织厚度 1 小时。

影响固视的因素

固定液体积必须至少是组织体积的 10-20 倍。体积不足会在渗透完成之前耗尽固定剂。 组织厚度： 切片厚度应不超过 4-5 毫米，以便充分穿透；较厚的部分在中心固定得不好。 温度： 较高的温度会加速固定，但会增加固定剂渗透之前的自溶；室温是日常使用的最佳温度。 搅拌： 轻轻旋转可改善标本周围的固定剂循环。 固定延迟： 必须尽量缩短热缺血时间（从血管夹紧到标本取出的时间）和冷缺血时间（从取出到固定的时间）。长时间的冷缺血会降解 RNA、蛋白质和磷蛋白（影响 IHC，特别是 ER 和磷酸特异性标记物）。

固定剂的类型

交联（醛）固定剂： 甲醛、戊二醛（用于 EM）、乙二醛（毒性较小的替代品）。戊二醛可提供出色的超微结构保存，但渗透缓慢并导致更多交联，这可能会掩盖 IHC 抗原。

凝固固定剂： 乙醇、甲醇、丙酮。这些通过破坏水合壳而不是交联来沉淀蛋白质。它们保留酶活性和核酸，但会引起更多收缩并迅速硬化组织。酒精固定用于 PCR 和分子检测。

组合固定剂： Bouin 溶液（苦味酸、甲醛、乙酸）可提供出色的核细节，用于内分泌组织、睾丸活检和胃肠道活检。 B5 固定剂（氯化汞、甲醛）过去曾用于淋巴结，但由于汞毒性，现在很少使用。福尔马林锌是一种用于保存淋巴抗原的无汞替代品。

非交联替代品： 分子固定剂（PAXgene、HOPE）可保存核酸和蛋白质以进行分子分析，但提供的形态学效果不如福尔马林。它们主要用于生物样本库和研究环境。

固定后处理

固定后，如果处理延迟，则将标本转移至 70% 乙醇中保存。组织可以在 70% 乙醇中保留数周而不会产生不良影响。在福尔马林中长时间保存（>72 小时）会导致过度固定，从而增加抗原掩蔽和 DNA 片段化。为了长期保存，福尔马林固定的组织可以在 24-48 小时后转移到乙醇中。

质量控制

通过固定剂新鲜度（定期更换溶液）、固定时间（在申请单上记录）、外观（固定良好的组织坚固且均匀苍白）和下游染色质量（固定不良表现为核细节差、苍白或 H&E 边缘效应）来监测固定。 质量保证计划 包括定期审查固定充分性指标。