荧光显微镜检测荧光团发出的波长长于激发波长的光。它可以在同一组织切片中同时对多个分子靶标进行高度特异性的可视化。共焦显微镜通过拒绝离焦光来扩展荧光成像，通过厚样本产生清晰的光学切片。

荧光原理

荧光团吸收特定激发波长的光子，将电子提升到更高的能态。当电子返回基态时，它会发射波长较长（能量较低）的光子，这种差异就是斯托克斯位移。荧光显微镜使用光源（汞弧、氙气、LED 或激光）、仅传输激发波长的激发滤光片、反射激发光并传输发射光的二向色镜，以及仅将发射波长传递到检测器的发射滤光片。

组织分析中常用的荧光团包括 DAPI（DNA，蓝色）、FITC（绿色）、TRITC（红色）和 Alexa Fluor 染料（提高亮度和光稳定性）。量子点是具有尺寸可调发射光谱的半导体纳米晶体，可以使用单一激发源进行多重分析。

组织中的免疫荧光

直接免疫荧光 使用直接与荧光团缀合的一抗。 间接免疫荧光 使用由荧光团偶联的二抗检测的未标记一抗 - 每个一抗来自多个二抗的信号放大增加了灵敏度。

福尔马林固定、石蜡包埋的组织中的免疫荧光需要与显色 IHC 相同的抗原修复。冰冻切片通常会产生更强的荧光，因为固定不会交联抗原。 来自脂褐素、弹性蛋白和红细胞的自发荧光可能会产生干扰，使用光谱分离或窄带滤光片可以最大限度地减少这种干扰。

多重免疫荧光 (mIF) 使用连续染色循环、酪酰胺信号放大 (TSA) 或光谱成像来检测单个切片上的 6-12 个标记。这使得能够详细表征肿瘤微环境，包括免疫细胞亚群、检查点分子表达和空间关系。

共焦显微镜

共焦显微镜在发射路径中使用针孔孔径来阻挡离焦光。只有来自焦平面的光到达检测器，产生约 0.5-1.0 µm 厚的光学切片。通过用激光扫描样本并收集连续的光学切片（z 堆栈），可以实现组织结构的三维重建。

激光扫描共焦显微镜 (LSCM) 使用聚焦激光束在样本上逐点扫描。它为多通道成像提供最高分辨率和灵活性。 转盘共焦显微镜使用带有数千个针孔的转盘，可以更快地捕获图像，同时减少光漂白，是活细胞成像的理想选择。

多光子显微镜

多光子（双光子）显微镜使用红外激光，其中两个较低能量的光子结合起来激发荧光团。这可以实现更深的组织穿透（高达 1 毫米）、降低光毒性以及无需针孔的固有光学切片。它用于活体动物的组织结构和细胞行为 活体成像。

在组织病理学中的应用

免疫荧光是肾脏病理学（IgA 肾病、狼疮性肾炎）、皮肤病理学（大疱性疾病）和神经病理学（阿尔茨海默氏病：β-淀粉样蛋白和 tau 蛋白共定位）的标准检测方法。 共焦显微镜能够对组织结构进行三维详细分析。 多重 IF 越来越多地用于免疫治疗研究，以绘制免疫细胞分布和 PD-L1 表达模式，以用于预测生物标志物开发。

限制

长时间激发下的荧光团光漂白（永久失去荧光），使用抗褪色封片剂并尽量减少光照。自发荧光是含有脂褐质的福尔马林固定组织（常见于衰老组织、心脏组织和肝脏组织）中的一个特殊问题，光谱分离或光漂白预处理可以有所帮助。共焦成像比宽场成像慢并且需要专门的设备和培训。