等温扩增方法在恒定温度下扩增核酸，无需热循环仪。它们越来越多地用于即时诊断、现场检测和资源有限的场所。

LAMP 概述

环介导等温扩增使用 4–6 个引物，识别靶序列上的 6–8 个不同区域。反应在 60–65 °C 下进行，使用具有链置换活性的 DNA 聚合酶。聚合酶持续置换新合成的链，形成环结构，作为进一步扩增的模板。

结果是指数级扩增，在一小时内产生高达 10⁹ 个拷贝。由于复杂的引物组和分支状扩增产物，LAMP 具有极高的特异性——可以区分单核苷酸差异。

LAMP 引物设计

LAMP 引物组包括：

• FIP（正向内部引物）：包含 F2 和 F1c 序列
• BIP（反向内部引物）：包含 B2 和 B1c 序列
• F3 和 B3（外部引物）：启动链置换
• 可选 环引物：通过引物环结构加速反应

引物设计至关重要，通常使用专用软件完成。靶区域应为 200–300 bp。

检测方法

LAMP 产物可通过以下方式检测：

• 浊度：扩增过程中形成的大量焦磷酸镁沉淀肉眼可见。
• 比色染料：当反应 pH 变化或镁被消耗时，酚红或羟基萘酚蓝会变色。
• 荧光：嵌入染料或钙黄绿素产生荧光信号。
• 侧向层析：使用标记的引物掺入半抗原，用于免疫层析试纸条检测。

其他等温方法

• RPA（重组酶聚合酶扩增）：使用重组酶将引物与同源双链 DNA 配对，单链 DNA 结合蛋白稳定置换链，以及链置换聚合酶。在 37–42 °C 下操作，5–20 分钟内产生可检测产物。RPA 是最快的等温方法，并兼容冻干形式。
• HDA（解旋酶依赖性扩增）：使用 DNA 解旋酶解开双螺旋而非热变性，在 37–65 °C 下操作。
• NASBA（核酸序列依赖性扩增）：在 41 °C 下使用三种酶扩增 RNA 靶标，产生 RNA 扩增子。

应用

等温扩增广泛用于病原体检测、食品安全检测和环境监测。在水浴或加热块中进行反应并通过颜色变化检测结果的能力使其成为分散式检测的理想选择。