概述

质谱法鉴定蛋白质是蛋白质组学的基石。基本工作流程包括使用胰蛋白酶等蛋白酶将蛋白质消化成肽，测量完整肽的质量 (MS1)，然后将选定的肽片段化以生成揭示其氨基酸序列的串联质谱 (MS/MS)。将所得光谱与源自蛋白质序列数据库的理论光谱进行匹配以指定身份。这种自下而上或鸟枪法具有高度可扩展性，可以在一次实验中从复杂混合物中识别出数千种蛋白质。

方法

肽质量指纹分析 (PMF) 通过将实验测量的肽质量列表与从数据库计算的理论肽质量进行匹配来识别蛋白质。 PMF 最适合简单的蛋白质混合物或通过 SDS-PAGE 等技术分离的纯化蛋白质。 串联 MS (MS/MS) 鉴定 将单个肽片段化以产生序列信息光谱。搜索引擎将观察到的碎片离子系列（主要是 b 离子和 y 离子）与候选肽的预测系列进行比较。 从头测序 当未找到数据库匹配时，直接从谱图推断肽序列，使用连续碎片离子之间的质量差异来推导序列。

实用协议

典型的蛋白质鉴定工作流程从蛋白质混合物开始，例如免疫沉淀复合物、SDS-PAGE 凝胶条带或[毛细管凝胶电泳](/guides/capillary-gel- electrophoresis) 组分。将蛋白质用 10 mM 二硫苏糖醇 (DTT) 在 56°C 下还原 30 分钟，用 55 mM 碘乙酰胺在黑暗中烷基化 30 分钟，并在 37°C 下以 1:50 的酶与底物比例用胰蛋白酶消化过夜。使用 C18 ZipTips 对所得肽进行脱盐，并将其加载到与 Orbitrap 质谱仪耦合的 nanoLC 系统上。该仪器以数据相关采集模式运行：以 70,000 分辨率从 350–1,600 m/z 进行完整 MS1 扫描，识别前 15 个最强的前体离子，这些前体离子通过 27% 归一化碰撞能量的高能碰撞解离 (HCD) 依次分离和碎片化，以产生 MS/MS 谱图。使用 Mascot 或 SEQUEST 在蛋白质数据库中搜索片段光谱。每个肽谱匹配均根据实验碎片离子与理论 b 和 y 离子系列之间的相关性进行评分。目标诱饵搜索估计 FDR，并在肽和蛋白质水平上以 1% FDR 过滤匹配项。蛋白质分组折叠了根据简约性映射到多个蛋白质的肽。现实世界的应用示例：通过生化分级分离和质谱法鉴定人类核孔复合物成分，揭示了 30 多种核孔蛋白，其中许多以前未表征，提供了核运输的全面分子图片。另一个应用是通过 MALDI-TOF MS 在临床微生物学中进行细菌鉴定，其中核糖体蛋白谱可作为分类指纹，在几分钟而不是几天内进行物种水平鉴定。

应用程序

蛋白质鉴定应用于整个分子生物学和临床研究。它确认了通过[蛋白质提取和纯化](/guides/ Protein-extraction-and-purification.html)获得的纯化蛋白质的身份，表征了蛋白质组学和质谱实验的成分，并鉴定了与诱饵蛋白共纯化的蛋白质复合物。在微生物学中，它用于通过基于质谱的蛋白质组学来鉴定细菌物种，补充基因组方法。