蛋白质定量是确定溶液中蛋白质浓度的过程。准确的蛋白质定量对于许多下游应用至关重要，包括 SDS-PAGE、蛋白质印迹、酶测定 和结构研究。

常见的蛋白质定量方法

布拉德福德测定

Bradford 测定基于考马斯亮蓝 G-250 染料与蛋白质的结合。当与蛋白质结合时，染料从棕色变为蓝色，最大吸光度从 465 nm 变为 595 nm。该测定快速、简单，并且与大多数缓冲液兼容。在存在清洁剂的情况下，其准确度较低。

BCA 测定

二辛可宁酸 (BCA) 测定依赖于碱性介质中蛋白质将 Cu2+ 还原为 Cu1+。然后 BCA 螯合 Cu1+，形成在 562 nm 处吸收的紫色。 BCA 测定比 Bradford 测定更能耐受去污剂，但与还原剂的兼容性较差。

洛瑞分析

Lowry 测定将缩二脲反应（铜螯合）与 Folin-Ciocalteu 试剂相结合，后者与酪氨酸和色氨酸残基发生反应。它产生在 750 nm 处测量的蓝色。它很敏感，但需要仔细计时，并受到许多干扰物质的影响。

紫外吸光度 (A280)

由于色氨酸和酪氨酸残基，蛋白质吸收 280 nm 的紫外线。 280 nm 处的吸光度可快速、无损地估计蛋白质浓度。对于具有已知消光系数的纯蛋白质来说，它是最准确的。

标准曲线

所有比色测定都需要标准曲线。制备并测量已知蛋白质标准品（通常是牛血清白蛋白（BSA））的系列稀释液。将未知样品的吸光度与标准曲线进行比较以计算其浓度。

实用 BCA 和 Bradford 检测方案

BCA 测定： 在与样品相同的缓冲液中连续稀释来制备 BSA 标准品 - 典型范围为 25–2000 µg/mL（0、25、125、250、500、750、1000、1500、2000 µg/mL）。将 25 µL 每种标准品或样品与 200 µL BCA 工作试剂（试剂 A 与试剂 B 的比例为 50:1）在 96 孔板中混合。 37°C 孵育 30 分钟。冷却至室温并测量 562 nm 处的吸光度。拟合二次或线性标准曲线。 BCA 检测与去污剂（SDS、Triton X-100）的兼容性高达 5%，但与还原剂（DTT、β-巯基乙醇）> 1 mM 不相容。 Bradford 测定： 准备相同范围 (25–1000 µg/mL) 的标准品。将 10 µL 标准品或样品与 200 µL Bradford 试剂（磷酸和甲醇中的考马斯 G-250 染料）混合。室温孵育 5 分钟。测量 595 nm 处的吸光度。 Bradford 检测速度快（2 分钟），并且与还原剂和螯合剂 (EDTA) 兼容，但会受到去污剂（>0.1% Triton X-100 或 SDS）的强烈抑制。对于这两种测定，均包括仅缓冲液的空白。每个标准品和样品应进行一式两份或一式三份测定。丢弃 CV > 15% 的读数。通过进一步稀释样品、切换测定法（如果样品含有还原剂，则使用 Bradford，如果样品含有去污剂，则使用 BCA）或进行 TCA/丙酮沉淀以去除干扰物质来解决高背景问题。

实际应用

当对 RIPA 缓冲液（含有 1% Triton X-100 和 0.1% SDS）中提取的哺乳动物细胞的蛋白质裂解物进行定量时，BCA 测定优于 Bradford。 RIPA 缓冲液中 25–2000 µg/mL BSA 的标准曲线显示 R² = 0.996。未知裂解物的 A562 = 0.45，相当于 1250 µg/mL。稀释后，每泳道上样 20 µg 进行 SDS-PAGE 或通过 [毛细管凝胶电泳](/guides/capillary-gel- electrophoresis) 进行分析。