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蛋白质定量

蛋白质定量是测定溶液中蛋白质浓度的过程。准确的蛋白质定量对于许多下游应用至关重要,包括SDS-PAGE、Western blotting、酶活性测定和结构研究。

常见的蛋白质定量方法

Bradford测定法

Bradford测定法基于考马斯亮蓝G-250染料与蛋白质的结合。染料与蛋白质结合后从棕色变为蓝色,最大吸收波长从465 nm变为595 nm。该方法快速、简单,且与大多数缓冲液兼容,但在有去污剂存在时准确性较低。

BCA测定法

二喹啉甲酸(BCA)测定法依赖于蛋白质在碱性介质中将Cu2+还原为Cu1+。BCA随后螯合Cu1+,形成在562 nm处有吸收的紫色物质。BCA测定法比Bradford测定法更能耐受去污剂,但与还原剂的兼容性较差。

Lowry测定法

Lowry测定法结合了双缩脲反应(铜螯合)和Folin-Ciocalteu试剂(与酪氨酸和色氨酸残基反应)。它产生在750 nm处测量的蓝色物质。该方法灵敏,但需要精确计时,且受许多干扰物质的影响。

紫外吸光度(A280)

蛋白质由于含有色氨酸和酪氨酸残基而在280 nm处吸收紫外光。280 nm处的吸光度提供了快速、非破坏性的蛋白质浓度估计。对于具有已知消光系数的纯蛋白质最为准确。

标准曲线

所有比色测定法都需要标准曲线。制备并测量已知蛋白质标准品(通常是牛血清白蛋白,BSA)的系列稀释液。将未知样品的吸光度与标准曲线进行比较以计算其浓度。