概述

RNA 测序 (RNA-seq) 已成为测量基因表达的标准方法，取代了早期基于杂交的方法。通过将 RNA 分子转化为 cDNA 文库并对数百万个片段进行测序，RNA-seq 可以提供生物样本中转录本的身份和丰度。与微阵列不同，RNA-seq 无需事先设计探针即可检测新的转录本、剪接变体和非编码 RNA。该技术提供了跨越几个数量级的动态范围和单碱基分辨率。 RNA-seq 数据支撑着从模式生物到临床标本的大多数现代转录组学研究。

关键概念

RNA-seq 分析流程从原始测序读数开始，进行质量控制 (FastQC)、接头修剪（Trimmomatic 或 Cutadapt），并使用 STAR 或 HISAT2 等剪接感知对准器比对到参考基因组。基因或转录本水平的定量是通过 featureCounts、RSEM 或 Salmon 等工具进行的。表达值标准化为 FPKM、RPKM 或 TPM，以考虑测序深度和转录本长度。 替代剪接 和新颖转录本的检测需要专门的工具，例如 Cufflinks 或 StringTie，它们可以根据比对的读数组装转录本。质量指标包括映射率、跨基因特征的读取分布和饱和度分析。

应用程序

RNA-seq 几乎应用于生物学的所有领域。它描绘了疾病与健康组织中的基因表达变化，识别癌症亚型的生物标志物，并跟踪发育基因表达程序。在微生物学中，RNA-seq 揭示了对抗生素和环境压力的转录反应。该技术直接建立在RNA 测序 方法的基础上，并且经常与[下一代测序](/guides/next- Generation-sequencing.html) 工作流程集成。 RNA-seq 还能够发现新颖的 [RNA 结构和类型](/guides/rna-struct-and-types.html)，包括长非编码 RNA 和环状 RNA，从而扩展我们对转录组复杂性的理解。

实用协议

标准批量 RNA-seq 流程从测序仪中的原始 FASTQ 文件开始。首先，运行“FastQC”来评估质量指标，包括每个碱基的质量评分、GC 含量、接头污染和过度表达的序列。使用“Trimmomatic”或“Cutadapt”修剪低质量碱基和残留适配器：典型的命令是“trimmomatic PE Sample_R1.fastq Sample_R2.fastq -baseout trimmed.fq ILLUMINACLIP:adapters.fa:2:30:10 LEADING:3 TRAILING:3 SLIDINGWINDOW:4:15 MINLEN:36”。对于剪接感知比对，“STAR”需要使用“STAR –runModegenomeGenerate –genomeFastaFilesgenome.fa –sjdbGTFfileannotation.gtf”构建的基因组索引。将读取与“STAR –runThreadN 8 –genomeDir star_index –readFilesIn trimmed_R1.fastq trimmed_R2.fastq –outSAMtype BAM SortedByCooperative”对齐。基因水平的量化使用“featureCounts -aannotation.gtf -o counts.txt -t exon -ggene_idaligned.bam”，生成一个计数矩阵，其中行是基因，列是样本。对于转录本级定量，“Salmon”提供无对齐估计：“salmon quant -i Salmon_index -l A -1 R1.fastq -2 R2.fastq -o quant_output”。要报告的质量控制指标包括独特映射的读取百分比（理想情况下> 80%）、外显子区域的映射率、3’ 偏差和 rRNA 污染水平。使用“preseq”评估文库复杂性，以估计更深层次的测序是否会产生额外的检测到的基因。最终计数矩阵加载到 R 中，使用 DESeq2 或 edgeR 进行差异表达分析。对于免对齐量化，Salmon 的准映射方法完全绕过了对齐步骤，在保持准确性的同时提供了更快的处理速度：salmon quant -i script_index -l A -1reads_R1.fastq -2reads_R2.fastq --validateMappings -o quant。 --validateMappings 标志提高了新转录本的敏感性。