概述

小 RNA 测序针对的是一类短非编码 RNA 分子（通常长度为 18-35 个核苷酸），它们在基因表达中发挥着关键的调节作用。这些包括 microRNA (miRNA)、小干扰 RNA (siRNA) 和 Piwi 相互作用 RNA (piRNA)。尽管尺寸很小，但这些分子对 mRNA 稳定性、翻译、染色质状态和转座子沉默发挥了强大的控制作用。 Small RNA-seq 需要专门的文库制备来捕获如此短的片段，并需要独特的生物信息学工具来进行准确的注释和定量。

方法

小 RNA-seq 文库制备涉及 RNA 大小选择（通常通过凝胶切除或基于微珠的纯化）、3’ 和 5’ 接头连接、逆转录和 PCR 扩增。由于小 RNA 比读取长度短，因此它们会被完整测序，并且在预处理过程中必须精确修剪接头序列。专用比对工具（例如 miRDeep2、sRNAbench 或 ShortStack）将读数映射到已知的小 RNA 数据库（miRNA 为 miRBase，其他 ncRNA 为 Rfam）。定量估计已知 miRNA 的表达水平，而新 miRNA 的检测则依赖于特征性发夹前体结构。差异表达分析遵循与 mRNA-seq 类似的原理，但需要特别考虑标准化，因为小 RNA 具有不同的长度分布和 GC 偏差。

应用程序

小 RNA 分析揭示了这些分子的普遍调节作用。 miRNA 特征可区分癌症亚型并预测治疗反应。血液或血清中的循环 miRNA 可作为癌症、心血管疾病和神经退行性疾病等疾病的微创生物标志物。该分析与更广泛的[RNA 结构和类型](/guides/rna-struct-and-types.html) 研究和[基因调控和表观遗传学](/guides/gene-regulation-and-epigenics.html) 相关，因为许多小 RNA 参与转录因子和表观遗传修饰剂的调控环路。了解小 RNA 生物发生也建立在转录和 RNA 加工 概念的基础上，特别是 Drosha 和 Dicer 在 miRNA 成熟中的作用。

实用协议

小 RNA-seq 文库的制备从总 RNA 输入 (100–1000 ng) 开始。大小选择至关重要：通过从 15% 聚丙烯酰胺凝胶中进行凝胶切除或使用特定 PEG 浓度的 AMPure XP 珠进行基于珠的纯化来分离 18-35 nt 的 RNA 片段。接头连接使用截短的 T4 RNA 连接酶 2 作为 3’ 接头（最小化环化），使用 T4 RNA 连接酶 1 作为 5’ 接头。使用 SuperScript III 反转录后，对 cDNA 进行 PCR 扩增（12-15 个循环以避免过度扩增）并再次选择大小以去除接头二聚体。对于预处理，“Cutadapt”精确修剪接头序列：“cutadapt -a TGGAATTCTCGGGTGCCAAGG –discard-untrimmed -m 18 -M 35 -o trimmed.fastq raw.fastq”。 --discard-untrimmed 标志删除没有可检测适配器的读取。对于 miRNA 发现和定量，“miRDeep2”提供了一个全面的管道：运行“mapper.pl”来处理读取，“miRDeep2.pl”来识别针对 miRBase 的已知和新颖的 miRNA，以及“quantifier.pl”来量化表达。该流程通过评估特征性发夹结构对候选 miRNA 前体进行评分：miRDeep2 评分高于 10 表示预测可信度高。替代工具包括用于具有不完整 miRBase 注释的物种的“sRNAbench”和用于在没有参考基因组的情况下从头发现小 RNA 的“ShortStack”。小RNA表达数据的标准化需要特别注意；选项包括 TPM（每百万转录本）、每百万读取数 (RPM) 或使用掺入对照，例如合成 cel-miR-39。可以使用“DESeq2”对计数数据进行差异表达分析，但大小因子估计应仅使用 miRNA 计数而不是总映射读数，以避免来自丰富的非 miRNA 小 RNA 的偏差。