酵母双杂交系统通过重建功能转录因子来检测活酵母细胞中蛋白质-蛋白质相互作用。它是发现和表征二元蛋白质相互作用的强大且广泛使用的方法。

原理

该系统基于转录因子的模块化性质，具有可分离的 DNA 结合域和激活域。感兴趣的蛋白质（或诱饵）与 Gal4 等转录因子的 DNA 结合域融合。潜在的相互作用蛋白或猎物融合到激活结构域。诱饵和猎物之间的相互作用使激活结构域与 DNA 结合结构域接近，从而重建激活报告基因表达的功能转录因子。

组件

诱饵通常被克隆到表达与 Gal4 DNA 结合域融合的诱饵蛋白的载体中。猎物由与 Gal4 激活域融合的文库载体表达。两种质粒都被转化到含有一个或多个受 Gal4 响应上游激活序列控制的报告基因的酵母报告菌株中。

报告基因通常包括 HIS3（允许在缺乏组氨酸的培养基上生长）、ADE2（用于腺嘌呤生物合成）以及 lacZ 或 GFP（用于比色或荧光检测）。多个记者与不同的发起人可以减少误报。 URA3和CYH2等反选择标记可以在某些条件下通过负选择消除假阳性。

图书馆筛选

典型的 Y2H 筛选从在猎物载体中构建 cDNA 文库开始。将诱饵转化为酵母报告菌株，通过大规模转化引入猎物文库。将转化体接种在需要相互作用才能生长的选择性培养基上。挑取 3 至 7 天后出现的菌落，回收猎物质粒并进行测序以鉴定相互作用蛋白。

筛选需要仔细优化。必须对诱饵进行自动激活测试，其中诱饵单独激活报告基因转录。如果发生自动激活，可以截断诱饵或使用替代载体。诱饵和猎物的表达水平都会影响敏感性。使用自动化和池化策略的高通量屏幕可实现全蛋白质组相互作用图谱。

优点和局限性

Y2H 可检测直接的二元相互作用，并可以识别免疫共沉淀和其他生化[蛋白质提取和纯化](/guides/ Protein-extraction-and-purification.html) 方法可能遗漏的微弱或短暂的相互作用。该系统可扩展以实现高通量、经济高效，并且不需要蛋白质特异性抗体。在真核细胞环境中检测相互作用。

局限性包括来自自激活剂、粘性蛋白和偶然相互作用的误报。当蛋白质在酵母中无法正确折叠、需要酵母中不存在的翻译后修饰或过度表达时有毒时，就会出现假阴性。膜蛋白存在问题，因为系统的核定位与膜环境不相容。诸如分裂泛素系统之类的变体解决了其中一些限制。

变体

几个 Y2H 变体扩展了基本技术。反向双杂交系统通过筛选报告基因表达的丢失来检测相互作用的破坏，这对于识别破坏特定相互作用的突变或药物很有用。该单杂交系统通过将 DNA 结合域与已知转录因子融合并筛选激活来检测蛋白质-DNA 相互作用。三杂交系统使用连接诱饵和猎物的杂交 RNA 分子来检测 RNA-蛋白质相互作用。

膜酵母双杂交采用分裂泛素方法，其中诱饵和猎物融合成一半的泛素。相互作用重建完整的泛素，它被泛素特异性蛋白酶切割，释放出激活报告基因的转录因子。这使得能够检测涉及膜蛋白在其天然环境中的相互作用。

应用程序

Y2H 已被用于生成酵母、苍蝇、蠕虫和人类等生物体的蛋白质组规模相互作用图谱。这些图谱揭示了功能模块，识别了新的途径成分，并预测了未表征蛋白质的功能。 Y2H 筛选已经确定了与疾病相关的相互作用，例如与遗传性疾病相关的基因编码的蛋白质之间的相互作用。该技术还被应用于绘制宿主与病原体相互作用的图谱，揭示病毒和细菌蛋白如何破坏宿主细胞机制。