PCR digital (dPCR) adalah penyempurnaan dari PCR konvensional yang memberikan kuantifikasi absolut asam nukleat tanpa memerlukan kurva standar. Sampel dipartisi menjadi ribuan reaksi individual kecil, dan setelah amplifikasi, jumlah partisi positif dan negatif dihitung.
Cara Kerja PCR Digital
- Partisi
Campuran PCR yang berisi sampel, primer, probe, dan polimerase dibagi menjadi ribuan partisi berukuran nanoliter. Hal ini dapat dilakukan dengan menggunakan chip dengan sumur mikro, tetesan dalam emulsi minyak (tetesan digital PCR), atau metode lainnya. Setiap partisi berisi nol atau setidaknya satu salinan DNA target.
- Amplifikasi
Sampel yang dipartisi mengalami siklus termal standar. Di setiap partisi, PCR berlangsung secara independen. Partisi yang mengandung DNA target menghasilkan produk yang diperkuat, sedangkan partisi kosong tidak menghasilkan produk apa pun.
- Deteksi Titik Akhir
Setelah amplifikasi, setiap partisi dianalisis untuk fluoresensi. Partisi yang mengandung DNA target yang diperkuat diberi skor positif (berpendar), sedangkan partisi yang tidak diberi skor negatif. Tidak diperlukan siklus kuantifikasi (Ct)—ini hanyalah pembacaan ya atau tidak per partisi.
- Statistik Poisson
Karena partisinya acak, beberapa partisi mungkin berisi banyak salinan target. Statistik Poisson digunakan untuk menghitung jumlah absolut molekul target dalam sampel asli berdasarkan proporsi partisi negatif.
- Aplikasi
PCR digital sangat presisi dan digunakan untuk mengukur mutasi langka, mendeteksi patogen dengan kelimpahan rendah, menganalisis variasi jumlah salinan, dan memverifikasi hasil NGS. Ini kurang sensitif terhadap inhibitor PCR dibandingkan qPCR dan memberikan kuantifikasi absolut tanpa standar.
Alur Kerja dPCR Praktis
Siapkan campuran utama PCR yang berisi sampel DNA (1–100 ng), primer, probe, dan minyak penghasil tetesan. Untuk PCR digital tetesan (ddPCR), masukkan campuran ke dalam generator tetesan yang mempartisi sampel menjadi ~20.000 tetesan nanoliter seragam dalam emulsi air dalam minyak. Untuk dPCR berbasis chip, sampel dimasukkan ke dalam chip mikrofluida dengan sumur mikro prefabrikasi (biasanya ~20.000 sumur). Pindahkan sampel yang telah dipartisi ke thermal cycler dan perkuat ke titik akhir menggunakan kondisi siklus standar. Setelah amplifikasi, baca fluoresensi setiap partisi menggunakan pembaca khusus. Partisi dengan DNA target menunjukkan fluoresensi di atas ambang batas yang ditetapkan secara manual dan diberi skor positif. Terapkan statistik Poisson: λ = −ln(1 − p) dengan p adalah pecahan partisi positif; konsentrasi target absolut (salinan/µL) adalah λ dibagi dengan volume partisi. Gunakan setidaknya 10.000 partisi yang diterima untuk kuantifikasi yang andal. Sertakan kontrol tanpa templat dan kontrol positif dengan nomor salinan yang diketahui. Untuk mendeteksi mutasi yang langka, gunakan probe fluoresen ganda — probe tipe liar berlabel FAM dan probe mutan dengan HEX — untuk membedakan molekul mutan dari molekul tipe liar dalam reaksi yang sama.
Aplikasi Dunia Nyata
Dalam biopsi cair untuk pemantauan kanker, ddPCR mendeteksi mutasi DNA tumor yang bersirkulasi (ctDNA) seperti EGFR T790M pada kanker paru-paru non-sel kecil. DNA plasma (10 ng) diekstraksi dari darah dan dianalisis dengan probe khusus mutasi. ddPCR menyelesaikan frekuensi alel mutan serendah 0,01%, jauh di bawah batas deteksi sekuensing Sanger. Jumlah salinan absolut molekul mutan per mL plasma dihitung, memungkinkan pelacakan longitudinal beban tumor dan deteksi dini resistensi pengobatan.
