Urutan sanger, juga dikenal sebagai urutan terminasi rantai, adalah metode yang digunakan untuk menentukan urutan nukleotida yang tepat dalam molekul DNA. Dikembangkan oleh Frederick Sanger pada tahun 1977, ini tetap menjadi standar emas untuk memvalidasi urutan DNA dan mendeteksi mutasi.
Cara Kerja Pengurutan Sanger
- Menyiapkan Reaksi
DNA yang akan diurutkan dicampur dengan primer DNA, DNA polimerase, nukleotida normal (dNTPs), dan sejumlah kecil dideoksinukleotida (ddNTPs) berlabel fluoresensi. Masing-masing dari empat ddNTP diberi label dengan pewarna fluoresen yang berbeda.
- Pemutusan Rantai
Reaksi dimulai dengan pengikatan primer pada DNA cetakan. DNA polimerase memperluas primer dengan menambahkan dNTP. Setiap kali ddNTP digabungkan dan bukan dNTP, rantainya berhenti tumbuh karena ddNTP kekurangan gugus 3’-hidroksil yang diperlukan untuk perluasan lebih lanjut.
- Pembuatan Fragmen
Proses ini menghasilkan campuran fragmen DNA dengan panjang yang bervariasi, masing-masing berakhir pada posisi nukleotida tertentu. Label fluoresen pada ddNTP terminasi mengidentifikasi basa mana yang berada di akhir setiap fragmen.
- Elektroforesis Kapiler
Campuran dimasukkan ke dalam instrumen elektroforesis kapiler, di mana pemisahan berdasarkan ukuran dilakukan dengan elektroforesis gel kapiler. Fragmen tersebut bermigrasi melalui matriks polimer di dalam kapiler dan dideteksi oleh fluoresensi yang diinduksi laser saat melewati jendela deteksi. Laser merangsang label fluoresen, dan detektor mencatat warna mana yang lewat pada setiap titik waktu.
- Analisis Kromatogram
Instrumen tersebut menghasilkan kromatogram—serangkaian puncak berwarna yang mewakili urutan nukleotida. Urutannya dibaca dari kromatogram, biasanya dari fragmen terpendek hingga terpanjang, sehingga menghasilkan urutan DNA lengkap.
Alur Kerja Pengurutan Sanger Praktis
Siapkan DNA templat dengan memurnikan produk PCR atau plasmid menggunakan kit pembersih kolom. Untuk pengurutan plasmid, gunakan 200–500 ng plasmid murni; untuk produk PCR, gunakan 1–10 ng per 100 bp amplikon. Siapkan reaksi pengurutan siklus dalam volume 10 µL: 2 µL BigDye Terminator v3.1 Campuran Reaksi Siap Pakai, 2 µL buffer pengurutan 5×, 1 µL primer (3,2 pmol/µL), DNA templat, dan air hingga 10 µL. Gunakan program siklus termal berikut: 96°C selama 1 menit, kemudian 25 siklus 96°C selama 10 detik, 50°C selama 5 detik, dan 60°C selama 4 menit. Memurnikan produk ekstensi dengan pengendapan etanol atau pembersihan manik magnetik untuk menghilangkan terminator pewarna yang tidak berhubungan. Masukkan sampel yang telah dimurnikan ke dalam instrumen elektroforesis kapiler (misalnya, Applied Biosystems 3730). Proses ini memisahkan fragmen berdasarkan ukurannya, dan laser merangsang pewarna fluoresen saat fragmen melewati jendela deteksi. Periksa kromatogram yang dihasilkan menggunakan perangkat lunak seperti FinchTV, SnapGene, atau Chromas. Data berkualitas baik biasanya mencakup 600–900 basis dari primer. Periksa puncak yang bersih dan berjarak sama dengan resolusi dasar. Polimorfisme nukleotida tunggal (SNP) muncul sebagai dua puncak yang tumpang tindih pada posisi yang sama. Kualitas yang buruk pada awal (20–40 basis pertama) dan akhir (setelah 800 basis) adalah hal yang normal — pangkas bagian ini sebelum dianalisis. Pecahkan masalah reaksi yang gagal dengan meningkatkan templat, mendesain ulang primer dengan Tm 60–65°C, atau menambahkan DMSO (2–5%) untuk templat yang kaya GC.
Aplikasi Dunia Nyata
Untuk mengonfirmasi gen yang diedit CRISPR pada embrio tikus, wilayah target diamplifikasi dengan PCR dan diurutkan Sanger. Kromatogram menunjukkan puncak campuran di dekat lokasi pemotongan, yang menunjukkan indel. Analisis ICE menguraikan jejak dan melaporkan efisiensi pengeditan 72% dengan penyisipan 1 bp sebagai alel yang paling umum. Pengurutan sanger tetap menjadi standar emas untuk memvalidasi pengeditan genom karena keakuratan dan efektivitas biayanya.
