Ikhtisar

Analisis K-mer menguraikan urutan biologis menjadi semua kemungkinan substring dengan panjang tetap k dan menghitung frekuensinya. Teknik sederhana namun kuat ini menangkap sifat komposisi genom dan transkriptom tanpa memerlukan penyelarasan, menjadikannya efisien secara komputasi dan bebas referensi. Distribusi frekuensi K-mer mengungkapkan ukuran genom, heterozigositas, konten berulang, dan tingkat kesalahan pengurutan dari pembacaan mentah sebelum langkah perakitan apa pun. Pemilihan k melibatkan trade-off: nilai k yang kecil (k < 20) memberikan penghitungan yang kuat namun daya diskriminatifnya terbatas, sedangkan nilai k yang besar (k > 50) menawarkan spesifisitas yang tinggi namun cakupannya lebih rendah.

Konsep Utama

Spektrum k-mer: histogram frekuensi kemunculan k-mer, mengikuti distribusi mirip Poisson pada data ideal. K-mer yang salah akibat kesalahan pengurutan muncul sebagai singleton (frekuensi 1), sedangkan k-mer genom asli membentuk puncak pada kedalaman cakupan yang diharapkan. Pengulangan genom menghasilkan puncak tambahan pada multiplisitas yang lebih tinggi. Alat seperti Jellyfish dan KMC secara efisien menghitung k-mer menggunakan tabel hash atau array sufiks. Selain penghitungan, metode berbasis k-mer juga mencakup jarak k-mer (fraksi k-mer bersama antara dua sampel) untuk filogeni, cakupan k-mer untuk memperkirakan ukuran genom, dan spektra k-mer untuk koreksi kesalahan dengan menghapus k-mer di bawah ambang batas cakupan.

Aplikasi

Analisis K-mer merupakan bagian integral dari kontrol kualitas pengurutan generasi berikutnya, mendeteksi kontaminasi dan memperkirakan cakupan sebelum perakitan. Dalam genetika bakteri, metode berbasis k-mer membedakan strain berdasarkan ciri komposisi uniknya. Binning metagenomik menggunakan vektor frekuensi k-mer untuk mengelompokkan contigs dari organisme yang sama. Proyek pengurutan DNA menggunakan penghitungan k-mer untuk memperbaiki kesalahan pengurutan dengan mengganti basis yang salah yang menghasilkan k-mer frekuensi rendah.

Protokol Praktis

Untuk penghitungan k-mer dengan Jellyfish, mulai dari file FASTQ mentah: jellyfish count -m 21 -s 100M -t 8 -C -o kmers.jf reads.fastq. Parameter: -m 21 menyetel ukuran k-mer ke 21 (kekhususan dan cakupan penyeimbangan default yang umum), -s 100M menyetel ukuran hash awal (peningkatan untuk genom besar), -C menghitung kedua untaian (k-mer kanonik), -t 8 menggunakan 8 thread. Untuk genom besar (manusia, ~3 Gb), tingkatkan ukuran hash: -s 3G. Hasilkan histogram frekuensi k-mer: jellyfish histo -o kmers.histo kmers.jf. Plot histogram untuk memvisualisasikan spektrum k-mer: puncak pertama pada frekuensi 1 mewakili kesalahan pengurutan (lajang), puncak utama pada kedalaman cakupan yang diharapkan mewakili genom k-mer asli, dan puncak tambahan pada frekuensi yang lebih tinggi menunjukkan urutan berulang. Perkirakan ukuran genom menggunakan rumus: genome_size = total_k_mers / peak_frekuensi. Misalnya, jika puncak utama berada pada cakupan 20× dan total k-mer adalah 60 juta, maka ukuran genom ≈ 3 juta bp. Gunakan GenomeScope (alat web) untuk menyesuaikan model spektrum k-mer dan memperkirakan ukuran genom, heterozigositas, dan konten berulang. Untuk mendeteksi kontaminasi, jalankan KMC untuk kumpulan data yang sangat besar: kmc -k21 -m64 -t8 -ci1 reads.fastq kmc_output workdir. Bandingkan spektrum k-mer dengan tanda tangan referensi yang diketahui; k-mer frekuensi tinggi yang tidak terduga dan tidak cocok dengan genom yang diharapkan mungkin mengindikasikan kontaminasi bakteri atau adaptor. Untuk binning metagenomik, hitung vektor frekuensi k-mer (biasanya frekuensi tetranukleotida, k=4) di jendela 5 kb di sepanjang rangkaian rakitan menggunakan seqtk comp atau skrip khusus, lalu kluster konfigurasi berdasarkan kesamaan komposisi menggunakan k-means atau pengelompokan hierarki yang diterapkan di MetaBAT2. Untuk diskriminasi regangan, gunakan Mash untuk menghitung jarak k-mer antara urutan kueri dan database referensi: mash sketch genome.fasta; mash dist genome.msh reference.msh > distances.txt. Jarak Mash memperkirakan tingkat mutasi antar genom.