Ekstraksi dan pemurnian protein merupakan teknik penting untuk mengisolasi protein spesifik dari campuran kompleks komponen seluler. Protein yang dimurnikan diperlukan untuk studi struktural, pengujian enzim, produksi antibodi, dan aplikasi terapeutik.

Cara Kerja Ekstraksi dan Pemurnian Protein

1. Lisis Sel

Langkah pertama adalah membuka sel untuk mengeluarkan isinya. Hal ini dilakukan dengan metode mekanis seperti homogenisasi, sonikasi, atau pemukulan manik, seringkali dengan adanya buffer lisis yang mengandung inhibitor protease untuk mencegah degradasi protein.

2. Klarifikasi

Lisat disentrifugasi menjadi pelet puing-puing yang tidak larut, termasuk membran sel dan organel. Supernatan, yang mengandung protein larut, dikumpulkan. Lisat yang telah diklarifikasi ini adalah bahan awal untuk pemurnian.

3. Pengendapan atau Fraksinasi

Langkah pengayaan awal terkadang digunakan. Pengendapan amonium sulfat secara selektif mengendapkan protein berdasarkan kelarutannya. Sentrifugasi diferensial dapat memisahkan protein berdasarkan ukuran dalam gradien kepadatan.

4. Kromatografi

Metode pemurnian yang paling ampuh adalah kromatografi kolom, yang memisahkan protein berdasarkan sifat berbeda:

• Kromatografi afinitas: Ligan atau antibodi spesifik pada kolom mengikat protein target.
• Kromatografi penukar ion: Protein dipisahkan berdasarkan muatan bersihnya.
• Kromatografi eksklusi ukuran: Protein dipisahkan berdasarkan ukuran dan bentuknya.

5. Elusi dan Pengumpulan

Protein target dilepaskan dari kolom dengan mengubah kondisi buffer—mengubah konsentrasi garam, pH, atau menambahkan ligan pesaing. Protein yang dimurnikan dikumpulkan dalam fraksi dan dianalisis kemurniannya.

6. Kontrol Kualitas

Protein yang dimurnikan dianalisis dengan SDS-PAGE atau elektroforesis gel kapiler (CGE) untuk memeriksa ukuran dan kemurniannya. Western blotting mengonfirmasi identitasnya. Konsentrasi diukur menggunakan uji kuantifikasi protein.

Ekstraksi Protein Praktis dan Protokol Pemurnian Tag-Nya

Panen sel (1 × 10⁷ sel mamalia atau 50 mL kultur bakteri) dengan sentrifugasi pada 500 × g selama 5 menit. Cuci pelet dengan PBS dingin. Suspensikan kembali dalam 500 µL buffer lisis RIPA (50 mM Tris-HCl pH 7,4, 150 mM NaCl, 1% Triton X-100, 0,5% natrium deoksikolat, 0,1% SDS) yang baru ditambah dengan 1× koktail protease inhibitor dan 1 mM PMSF. Untuk sel bakteri yang mengekspresikan protein bertanda His, gunakan buffer lisis denaturasi (8 M urea, 100 mM NaH2PO4, 10 mM Tris-HCl pH 8,0) atau buffer asli (50 mM NaH2PO4, 300 mM NaCl, 10 mM imidazol pH 8,0). Melisiskan sel dengan sonikasi di atas es: 3 pulsa 15 detik pada amplitudo 30% dengan interval pendinginan 30 detik. Sentrifugasi pada 15.000 × g selama 30 menit pada suhu 4°C dan kumpulkan supernatannya. Setarakan 1 mL resin agarosa Ni-NTA dalam kolom gravitasi dengan 10 volume kolom buffer pengikat. Oleskan lisat yang telah diklarifikasi dan kumpulkan alirannya. Cuci dengan buffer pencuci volume 10 kolom (buffer pengikat dengan imidazol 20–50 mM). Elusi protein bertanda His dalam fraksi 5 × 1 mL menggunakan buffer elusi (buffer pengikat dengan imidazol 250 mM). Analisis 20 µL setiap fraksi (lisat, flow-through, wash, elution) dengan SDS-PAGE 12%. Pewarnaan dengan Coomassie Blue untuk memvisualisasikan protein target — pita tunggal dengan berat molekul yang diharapkan dalam fraksi elusi menunjukkan keberhasilan pemurnian. Untuk kemurnian yang lebih tinggi, kumpulkan fraksi elusi dan jalankan pada kolom kromatografi eksklusi ukuran (Superdex 200) yang diseimbangkan dengan buffer penyimpanan (50 mM Tris-HCl pH 7,4, 150 mM NaCl, 10% gliserol).

Aplikasi Dunia Nyata

Human kinase 6×His-tagged (MAPK14/p38α, 41 kDa) diekspresikan dalam E. coli BL21(DE3) dengan induksi IPTG 0,5 mM selama 4 jam pada suhu 30°C. Setelah pemurnian Ni-NTA, SDS-PAGE menunjukkan pita 41 kDa yang menonjol dalam fraksi elusi dengan kemurnian >90%. Protein dipekatkan hingga 5 mg/mL, dibekukan dalam nitrogen cair, dan mempertahankan aktivitas kinase >80% dalam uji fosforilasi.