PCR transkripsi terbalik (RT-PCR) adalah teknik yang digunakan untuk mendeteksi dan memperkuat RNA. Ini menggabungkan dua langkah: membalikkan transkripsi RNA menjadi DNA komplementer (cDNA), diikuti dengan amplifikasi PCR dari cDNA. Hal ini memungkinkan para ilmuwan mempelajari ekspresi gen dan mendeteksi virus RNA.
Cara Kerja RT-PCR
- Ekstraksi RNA
Total RNA diekstraksi dari sampel dan diolah dengan DNase untuk menghilangkan DNA genom yang terkontaminasi. Kualitas dan konsentrasi RNA diperiksa sebelum melanjutkan.
- Transkripsi Terbalik
RNA dicampur dengan enzim transkriptase balik, primer acak atau primer oligo-dT, dan nukleotida. Transkriptase balik menggunakan RNA sebagai cetakan untuk mensintesis untai DNA komplementer. Templat RNA kemudian didegradasi oleh RNase H, meninggalkan cDNA beruntai tunggal.
- Amplifikasi PCR
CDNA kemudian digunakan sebagai templat untuk PCR standar dengan primer spesifik gen. PCR memperkuat cDNA, menghasilkan DNA yang cukup untuk divisualisasikan pada gel atau diukur dengan qPCR.
- Deteksi
Produk PCR yang diamplifikasi dianalisis dengan elektroforesis gel agarosa. Kehadiran pita pada ukuran yang diharapkan menegaskan bahwa RNA target ada dalam sampel asli.
- Aplikasi
RT-PCR banyak digunakan untuk mengukur tingkat ekspresi gen, mendeteksi virus RNA seperti HIV dan SARS-CoV-2, memvalidasi data pengurutan RNA, dan menganalisis penyambungan alternatif. Ketika dikombinasikan dengan qPCR, ia menjadi RT-qPCR, memungkinkan kuantifikasi RNA secara real-time.
Protokol RT-PCR Praktis
Mulailah dengan mengekstraksi RNA total menggunakan kolom silika atau metode berbasis TRIzol. Nilai integritas RNA dengan elektroforesis gel agarosa atau bioanalyzer — RNA utuh menunjukkan pita ribosom 28S dan 18S yang tajam dengan rasio 28S:18S mendekati 2:1. Ukur konsentrasi dan kemurnian dengan spektrofotometri UV (A260/A280 > 1.8, A260/A230 > 2.0). Perlakukan 1–5 μg RNA dengan DNase I pada suhu 37°C selama 30 menit, kemudian inaktivasi panas pada suhu 75°C selama 10 menit. Untuk transkripsi terbalik, campurkan RNA yang diberi perlakuan DNase dengan heksamer acak atau primer oligo-dT (50–250 ng), 1 mM dNTP, dan 200 U transkriptase balik dalam buffer yang disediakan. Inkubasi pada suhu 25°C selama 10 menit, 42°C selama 50 menit, dan 70°C selama 15 menit. Encerkan cDNA yang dihasilkan 5–10 kali lipat sebelum amplifikasi PCR. Selalu sertakan kontrol no-reverse-transcriptase (no-RT) untuk mendeteksi kontaminasi DNA genom — jika sampel tanpa RT menghasilkan produk PCR, terdapat sisa DNA. Untuk primer spesifik gen, rancang primer tersebut agar menjangkau persimpangan ekson-ekson untuk menghindari penguatan DNA genom; primer maju pada satu ekson dan primer terbalik pada ekson hilir memastikan bahwa hanya cDNA yang disambung yang diperkuat.
Aplikasi Dunia Nyata
Dalam diagnostik SARS-CoV-2, RT-PCR menargetkan gen virus N, E, dan RdRp menggunakan set pemeriksaan primer CDC atau WHO. RNA diekstraksi dari usap nasofaring, dan RT-qPCR dengan probe berlabel ganda mendeteksi RNA virus pada ambang batas siklus (Ct) di bawah 40. Hasil positif pada dua dari tiga target gen memastikan adanya infeksi. Dimasukkannya pengendalian internal (misalnya, RNase P manusia) memverifikasi kecukupan sampel dan keberhasilan ekstraksi, mencegah kesalahan negatif dari pengumpulan sampel yang buruk.
