Ikhtisar
Perakitan sekuens adalah proses komputasi untuk merekonstruksi genom atau transkriptom lengkap dari jutaan atau miliaran fragmen DNA pendek yang dihasilkan oleh pengurutan. Karena mesin pengurutan hanya membaca 150–300 pasangan basa dalam satu waktu, algoritme perakitan harus menemukan tumpang tindih di antara pembacaan, menggabungkannya menjadi rangkaian yang lebih panjang dan bersebelahan (contigs), dan mengurutkan contig ke dalam perancah. Kesulitan perakitan meningkat seiring dengan ukuran genom, konten berulang, dan heterozigositas. Kualitas perakitan diukur dengan metrik seperti N50 (panjang contig yang mencakup 50% perakitan) dan jumlah total contig.
Metode
Ada dua paradigma perakitan utama. Overlap-layout-consensus (OLC), digunakan oleh Canu dan Flye untuk pembacaan yang panjang, menghitung semua tumpang tindih berpasangan di antara pembacaan, membuat grafik, dan menyelesaikan jalur untuk menghasilkan urutan konsensus. Perakit Grafik De Bruijn, seperti SPAdes dan Velvet, menguraikan bacaan menjadi k-mer dan membuat grafik dengan k-mer adalah simpul dan tepi mewakili k-1 yang tumpang tindih; pendekatan ini menskalakan secara efisien ke genom besar dengan cakupan tinggi. Perakit hibrid menggabungkan keakuratan pembacaan singkat dengan informasi jangka panjang dari pembacaan panjang untuk menyelesaikan wilayah yang berulang. Perakit metagenomik seperti MEGAHIT menangani komunitas mikroba campuran dengan mengakomodasi kedalaman cakupan yang bervariasi antar spesies.
Aplikasi
Perakitan genom de novo menghasilkan genom referensi untuk organisme yang baru diurutkan, termasuk bakteri, tumbuhan, dan vertebrata. Dalam proyek pengurutan generasi berikutnya, perakitan adalah langkah pertama sebelum anotasi dan analisis. Perakitan transkriptome dari pengurutan DNA berbunyi mengungkapkan isoform yang disambung secara alternatif. Teknologi DNA rekombinan menggunakan perakitan untuk memverifikasi konstruksi plasmid dengan merakit pembacaan pengurutan Sanger dari sisipan yang dikloning.
Protokol Praktis
Untuk perakitan pengurutan Sanger menggunakan Phred/Phrap/Consed, mulailah dengan file jejak ABI mentah (.ab1). Panggilan dasar dengan Phred mengubah jejak menjadi urutan berkualitas tinggi dengan skor kualitas per basis: phred -id seqs_dir -qd seqs_phd_dir -sd seqs_fasta_dir. Phred melaporkan skor kualitas pada skala Phred (-10 × log₁₀(probabilitas_kesalahan)), dengan Q20 = akurasi 99% dan Q30 = akurasi 99,9%. Merakit bacaan dengan Phrap: phrap seqs_fasta_dir/*.fasta -ace > assembly.log. Phrap menggunakan algoritma Smith-Waterman berpita dengan skor kualitas untuk menghitung urutan konsensus dan menyusun bacaan ke dalam contigs. Lihat dan edit rakitan secara manual di Consed: consed -acephap ace_file. Consed menampilkan pembacaan yang selaras dengan kode warna kualitas dasar, menyoroti perbedaan, dan memungkinkan pengeditan konsensus secara manual. Arahkan ke area bermasalah yang ditandai oleh Phrap sebagai ketidaksesuaian kualitas tinggi (bilah merah) atau area berkualitas rendah (sorotan biru). Selesaikan perbedaan secara manual dengan memeriksa kromatogram untuk setiap pembacaan, memotong ujung yang berkualitas rendah, dan mengoreksi basa yang salah penamaan. Hasilkan urutan konsensus akhir yang diperiksa kualitasnya: File → Ekspor Konsensus. Untuk perakitan de novo genom bakteri kecil dari pembacaan Illumina, gunakan SPAdes dengan tanda --isolate untuk data strain tunggal. Menilai kelengkapan perakitan dengan QUAST dengan menghitung konten N50, L50, dan GC. Untuk penyelesaian akhir, urutkan contigs menggunakan CONTIGUATOR terhadap referensi yang terkait erat, lalu tutup celah dengan merancang primer di seluruh ujung contig untuk pengurutan PCR dan Sanger. Verifikasi perakitan akhir dengan menyelaraskan pembacaan kembali dengan BWA-MEM dan memeriksa keseragaman cakupan.
