数字 PCR (dPCR) 是传统 PCR 的改进，无需标准曲线即可提供核酸的绝对定量。样品被分成数千个微小的单独反应，扩增后，计算阳性和阴性分区的数量。
数字 PCR 的工作原理
- 分区
含有样品、引物、探针和聚合酶的 PCR 混合物被分成数千个纳升大小的分区。这可以使用带有微孔的芯片、油乳液中的液滴（液滴数字 PCR）或其他方法来完成。每个分区包含零个或至少一个目标 DNA 副本。
- 放大
分配的样品经历标准热循环。在每个分区中，PCR 独立进行。含有目标 DNA 的分区会产生扩增产物，而空分区则不会产生扩增产物。
- 终点检测
扩增后，分析每个分区的荧光。含有扩增目标 DNA 的分区被评分为阳性（荧光），而那些没有被评分为阴性。不需要量化周期（Ct）——它只是每个分区的“是”或“否”读数。
4.泊松统计
由于分区是随机的，某些分区可能包含目标的多个副本。泊松统计用于根据负分区的比例计算原始样本中目标分子的绝对数量。
- 应用
数字 PCR 精度很高，用于定量罕见突变、检测低丰度病原体、分析拷贝数变异以及验证 [NGS](/guides/next- Generation-sequencing.html) 结果。它对 PCR 抑制剂的敏感度低于 qPCR，并且无需标准品即可提供绝对定量。
实用 dPCR 工作流程
准备含有样品 DNA (1–100 ng)、引物、探针和液滴生成油的 PCR 主混合物。对于液滴数字 PCR (ddPCR)，将混合物加载到液滴发生器中，将样品分成油包水乳液中约 20,000 个均匀的纳升液滴。对于基于芯片的 dPCR，样品被加载到具有预制微孔（通常约 20,000 个孔）的微流控芯片中。将分配的样品转移至热循环仪，并使用标准循环条件扩增至终点。扩增后，使用专用读数器读取每个分区的荧光。具有目标 DNA 的分区显示荧光高于手动设置的阈值，并评分为阳性。应用泊松统计： λ = −ln(1 − p) 其中 p 是正分区的分数；绝对目标浓度（份数/μL）是 λ 除以分区体积。使用至少 10,000 个可接受的分区进行可靠的量化。包括无模板对照和已知拷贝数的阳性对照。对于罕见突变检测，可使用双荧光探针（用 FAM 标记的野生型探针和用 HEX 标记的突变型探针）在同一反应中区分突变型和野生型分子。
实际应用
在用于癌症监测的液体活检中，ddPCR 可检测循环肿瘤 DNA (ctDNA) 突变，例如非小细胞肺癌中的 EGFR T790M。从血液中提取血浆 DNA (10 ng)，并使用突变特异性探针进行分析。 ddPCR 解析突变等位基因频率低至 0.01%，远低于 Sanger 测序的检测限。计算每毫升血浆中突变分子的绝对拷贝数，从而能够纵向跟踪肿瘤负荷并早期检测治疗耐药性。
