桑格测序，也称为链终止测序，是一种用于确定 DNA 分子中核苷酸的确切顺序的方法。它由 Frederick Sanger 于 1977 年开发，至今仍然是验证 DNA 序列和检测突变的黄金标准。
桑格测序的工作原理
- 设置反应
待测序的 DNA 与 DNA 引物、DNA 聚合酶、正常核苷酸 (dNTP) 和少量荧光标记的双脱氧核苷酸 (ddNTP) 混合。四种 ddNTP 中的每一种都用不同的荧光染料标记。
- 链终止
反应从引物与模板 DNA 结合开始。 DNA 聚合酶通过添加 dNTP 来延伸引物。每当掺入 ddNTP 而不是 dNTP 时，链就会停止生长，因为 ddNTP 缺乏进一步延伸所需的 3’-羟基。
- 片段生成
这个过程产生不同长度的 DNA 片段的混合物，每个片段都以特定的核苷酸位置结束。终止 ddNTP 上的荧光标记可识别每个片段末端的碱基。
- 毛细管电泳
将混合物加载到[毛细管电泳](/guides/capillary- electrophoresis)仪器中，其中通过[毛细管凝胶电泳](/guides/capillary-gel- electrophoresis)进行基于尺寸的分离。这些片段通过毛细管内的聚合物基质迁移，并在通过检测窗口时被激光诱导荧光检测到。激光激发荧光标签，检测器记录每个时间点经过的颜色。
- 色谱分析
仪器产生色谱图——代表核苷酸序列的一系列彩色峰。从色谱图中读取序列，通常从最短的片段到最长的片段，给出完整的 DNA 序列。
实用桑格测序工作流程
使用柱净化试剂盒纯化 PCR 产物或质粒来制备模板 DNA。对于质粒测序，使用 200–500 ng 纯化质粒；对于 PCR 产物，每 100 bp 扩增子使用 1–10 ng。在 10 µL 体积中设置循环测序反应：2 µL BigDye Terminator v3.1 Ready Reaction Mix、2 µL 5× 测序缓冲液、1 µL 引物 (3.2 pmol/µL)、模板 DNA 和水至 10 µL。使用以下热循环程序：96°C 1 分钟，然后 96°C 10 秒、50°C 5 秒和 60°C 4 分钟的 25 个循环。通过乙醇沉淀或磁珠净化来纯化延伸产物，以去除未掺入的染料终止剂。将纯化的样品加载到毛细管电泳仪器（例如，Applied Biosystems 3730）上。该运行按大小分离片段，当片段通过检测窗口时，激光激发荧光染料。使用 FinchTV、SnapGene 或 Chromas 等软件检查生成的色谱图。高质量的数据通常从引物延伸 600-900 个碱基。使用基线分辨率检查干净、间隔均匀的峰。单核苷酸多态性 (SNP) 在同一位置显示为两个重叠的峰。开头（前 20-40 个碱基）和结尾（800 个碱基后）质量差是正常现象 - 在分析前修剪这些区域。通过增加模板、重新设计 Tm 为 60–65°C 的引物或为富含 GC 的模板添加 DMSO (2–5%) 来解决失败的反应。
实际应用
为了确认小鼠胚胎中的 CRISPR 编辑基因，对目标区域进行 PCR 扩增并进行 Sanger 测序。色谱图显示切割位点附近的混合峰，表明插入/缺失。 ICE 分析分解轨迹并报告 72% 的编辑效率，其中 1 bp 插入是最常见的等位基因。由于其准确性和成本效益，桑格测序仍然是验证基因组编辑的黄金标准。
