免疫组织化学 (IHC) 是一种使用与可检测标记结合的抗体来可视化组织切片中的特定抗原的技术。它连接了形态学和分子身份，使病理学家不仅可以看到细胞的外观，还可以看到它们表达的蛋白质。 IHC 已成为诊断病理学中不可或缺的一部分，特别是对于肿瘤分类 和预测生物标志物测试。

抗体类型

多克隆抗体是通过用目标抗原免疫动物（兔子、山羊）来产生的；所得血清含有识别不同表位的抗体混合物。它们具有较高的灵敏度，但特异性较低且批次间存在差异。

单克隆抗体 由单个 B 细胞克隆与骨髓瘤细胞融合产生杂交瘤而产生。它们识别单个表位，提供高特异性和可重复的性能。小鼠单克隆抗体历来是标准，但兔单克隆抗体现在占主导地位，因为它们由于具有更高的亲和力和与更多样化的表位的结合而提供更好的灵敏度。

重组抗体是根据测序的抗体基因设计的，无需动物免疫。它们提供无与伦比的一致性，并且可以针对特定格式（Fab 片段、单链变体、双特异性抗体）进行设计。

检测系统

直接 IHC 使用直接与标记（酶或荧光团）缀合的一抗。它简单、快速，但缺乏灵敏度，因为每种抗原只有一种标记抗体结合。

间接 IHC 使用未标记的一抗，通过标记的二抗检测，该二抗针对一抗的物种特异性 Fc 区。每个初级结合的多个次级结合的扩增增加了灵敏度。

基于聚合物的检测使用与多个二抗和多个酶分子缀合的聚合物主链（葡聚糖或类似物）。这提供了强大的信号放大，而没有抗生物素蛋白-生物素系统的背景问题。

抗生物素蛋白-生物素复合物 (ABC) 方法 利用抗生物素蛋白（或链霉抗生物素蛋白）对生物素的高亲和力。通过预先形成的抗生物素蛋白和生物素化酶复合物来检测生物素化二抗。虽然敏感，但组织（肝、肾、脑）中的内源生物素可能会导致背景染色。

显色剂和荧光团

DAB（3,3’-二氨基联苯胺） 在目标抗原位点产生棕色不溶性沉淀。它具有耐酒精性和永久性，使其成为明场 IHC 中使用最广泛的显色剂。

固红和 AEC 产生可溶于醇的红色沉淀，需要水性封固剂。当与 DAB 结合时，它们可用于双重 IHC。

荧光团（FITC、TRITC、Alexa 染料）可实现具有光谱分离的多标记免疫荧光，从而实现多个抗原的同时可视化。

抗原修复

福尔马林固定会产生亚甲基桥交联，掩盖许多表位，使抗体无法接近它们。 热诱导表位修复 (HIER) 使用微波炉、高压锅或水浴在柠檬酸盐缓冲液 (pH 6.0) 或 Tris-EDTA 缓冲液 (pH 9.0) 中加热切片 20-40 分钟，破坏交联并恢复抗原性。 酶法修复使用蛋白酶（胰蛋白酶、蛋白酶 K、胃蛋白酶）来检测对热敏感的抗原。检索方法的选择是抗体特异性的，并在 IHC 验证 期间进行优化。

控制和解释

每次 IHC 运行必须包括一个阳性对照（已知以预期强度和定位表达靶抗原的组织 - 细胞核、细胞质或膜）和阴性对照（未经一抗处理的相同组织）。内部阳性对照（同一切片中应表达抗原的非肿瘤细胞）提供了额外的验证。染色被解释为阳性或阴性，注意亚细胞定位，预期显示核染色（ER、Ki-67）的抗体显示细胞质染色可能是非特异性的。