蛋白质提取和纯化是从复杂的细胞成分混合物中分离特定蛋白质的基本技术。结构研究、酶测定、抗体生产和治疗应用需要纯化的蛋白质。
蛋白质提取和纯化的工作原理
- 细胞裂解
第一步是打开细胞以释放其内容物。这是通过机械方法（例如均质化、超声处理或珠磨）来完成的，通常在含有蛋白酶抑制剂的裂解缓冲液存在下以防止蛋白质降解。
- 澄清
将裂解物离心以沉淀不溶性碎片，包括细胞膜和细胞器。收集含有可溶性蛋白质的上清液。该澄清的裂解物是纯化的起始材料。
- 沉淀或分馏
有时使用初始富集步骤。硫酸铵沉淀根据蛋白质的溶解度选择性沉淀蛋白质。差速离心可以按密度梯度的大小分离蛋白质。
- 色谱法
最强大的纯化方法是柱色谱法，它根据不同的特性分离蛋白质：
- 亲和层析：柱上的特定配体或抗体与目标蛋白结合。
- 离子交换色谱：蛋白质通过其净电荷进行分离。
- 尺寸排阻色谱法：蛋白质根据其尺寸和形状进行分离。
- 洗脱和收集
通过改变缓冲液条件（改变盐浓度、pH 值或添加竞争性配体），目标蛋白从柱中释放。将纯化的蛋白质收集在级分中并分析纯度。
- 质量控制
通过 SDS-PAGE 或 [毛细管凝胶电泳](/guides/capillary-gel- electrophoresis) (CGE) 分析纯化的蛋白质，以检查其大小和纯度。 蛋白质印迹 确认其身份。使用蛋白质定量测定来测量浓度。
实用蛋白质提取和 His 标签纯化方案
500 × g 离心 5 分钟收获细胞（1 × 10⁷ 哺乳动物细胞或 50 mL 细菌培养物）。用冰冷的 PBS 清洗沉淀。在 500 μL 的 RIPA 裂解缓冲液（50 mM Tris-HCl pH 7.4、150 mM NaCl、1% Triton X-100、0.5% 脱氧胆酸钠、0.1% SDS）中重新悬浮，新鲜补充有 1× 蛋白酶抑制剂混合物和 1 mM PMSF。对于表达 His 标记蛋白的细菌细胞，请使用变性裂解缓冲液（8 M 尿素、100 mM NaH2PO4、10 mM Tris-HCl pH 8.0）或天然缓冲液（50 mM NaH2PO4、300 mM NaCl、10 mM 咪唑 pH 8.0）。在冰上超声裂解细胞：3 个 15 秒脉冲，振幅 30%，冷却间隔 30 秒。 4°C、15,000 × g 离心 30 分钟，收集上清液。在重力柱中用 10 柱体积的结合缓冲液平衡 1 mL Ni-NTA 琼脂糖树脂。应用澄清的裂解液并收集流出液。用 10 倍柱体积的洗涤缓冲液（含有 20–50 mM 咪唑的结合缓冲液）洗涤。使用洗脱缓冲液（含 250 mM 咪唑的结合缓冲液）洗脱 5 × 1 mL 级分中的 His 标记蛋白。通过 12% SDS-PAGE 分析 20 µL 各组分（裂解液、流穿液、洗涤液、洗脱液）。用考马斯蓝染色以可视化目标蛋白 - 洗脱组分中预期分子量的单条带表明纯化成功。为了获得更高的纯度，合并洗脱组分并在用存储缓冲液（50 mM Tris-HCl pH 7.4、150 mM NaCl、10% 甘油）平衡的尺寸排阻色谱柱（Superdex 200）上运行。
实际应用
6×His 标记的人激酶（MAPK14/p38α，41 kDa）在大肠杆菌 BL21(DE3) 中表达，用 0.5 mM IPTG 在 30°C 诱导 4 小时。 Ni-NTA 纯化后，SDS-PAGE 在洗脱组分中显示出明显的 41 kDa 条带，纯度 >90%。该蛋白质浓缩至 5 mg/mL，在液氮中快速冷冻，并在磷酸化测定中保留 >80% 的激酶活性。
