概述

定量蛋白质组学旨在测量不同生物条件下蛋白质丰度的变化。与仅确定蛋白质存在的定性鉴定不同，定量揭示了蛋白质组如何对刺激、疾病或治疗做出反应。该领域主要有两种策略：基于标记的方法，将稳定同位素标签引入蛋白质或肽；以及无标记方法，从光谱计数或离子强度推断丰度。每种方法都在准确性、复用能力、成本和实验复杂性之间进行权衡，使得方法的选择高度依赖于所提出的生物学问题。

方法

稳定同位素标记技术包括 SILAC（细胞培养中的代谢标记）、TMT 和 iTRAQ（用于相对和绝对定量的同位素标签）以及二甲基标记。这些引入了质谱仪可以区分的确定的质量位移，允许在单次运行中对多达 16 个样品进行多重分析。 无标记定量 使用已识别光谱的数量（光谱计数）或每个肽的提取离子色谱图面积（MS1 强度）。 SWATH-MS 等数据独立采集 (DIA) 方法将深度蛋白质组覆盖与大样本队列的定量精度相结合。

实用协议

基于 SILAC 的定量蛋白质组学实验从代谢标记开始。细胞在“轻”（Arg-0、Lys-0）或“重”（Arg-10、Lys-8）培养基中培养至少五次细胞倍增，以实现完全合并。轻细胞和重细胞处于不同的条件下，例如，抑制剂处理与载体对照。裂解后，根据总蛋白浓度以 1:1 的比例组合蛋白质，用胰蛋白酶消化，并通过基本反相 HPLC 分级为 12-24 个级分。每个馏分均在高分辨率质谱仪上通过 LC-MS/MS 进行分析。该仪器检测由重标记引入的质量位移分开的成对肽峰。定量发生在 MS1 水平：软件提取每个肽对的离子色谱图并计算重轻比。 MaxQuant 处理原始文件，并通过将中值 log2 比率居中为零来标准化所得蛋白质比率，从而纠正较小的混合错误。两个样本 t 检验或带有 Benjamini-Hochberg 校正的方差分析可识别显着变化的蛋白质。对于基于 TMT 的实验，标记发生在消化后的肽水平，并使用 MS/MS 谱图中的报告离子强度进行定量，从而能够同时对多达 16 个样品进行多重比较。在一项具有里程碑意义的应用中，基于 TMT 的定量蛋白质组学对 10 个乳腺癌细胞系中的 10,000 种蛋白质进行了定量，揭示了与致癌信号传导相关的代谢途径的协调调节。 SILAC 已用于分析慢性粒细胞白血病细胞对伊马替尼治疗的酪氨酸磷酸蛋白质组反应，确定靶点参与和耐药机制。

应用程序

定量蛋白质组学广泛应用于生物标志物发现，比较健康组织和患病组织之间的蛋白质水平，以确定诊断或预后特征。在药物开发中，它描述了靶标参与和脱靶效应。定量数据与 ELISA 和 Western blot 验证的集成确保了稳健性。基于质谱 的定量方法补充了传统的基于凝胶的方法，例如SDS-PAGE 和[毛细管凝胶电泳](/guides/capillary-gel- electrophoresis) (CGE)，提供更深的覆盖范围和更高的通量。