逆转录 PCR (RT-PCR) 是一种用于检测和扩增 RNA 的技术。它结合了两个步骤：将 RNA 逆转录为互补 DNA (cDNA)，然后对 cDNA 进行 PCR 扩增。这使得科学家能够研究基因表达并检测 RNA 病毒。
RT-PCR 的工作原理
1.RNA提取
从样品中提取总 RNA，并用 DNase 处理以去除任何污染的基因组 DNA。在继续之前检查 RNA 质量和浓度。
- 反转录
RNA 与逆转录酶、随机引物或寡聚 dT 引物以及核苷酸混合。逆转录酶使用RNA作为模板来合成互补的DNA链。然后 RNA 模板被 RNase H 降解，留下单链 cDNA。
- PCR 扩增
然后将该 cDNA 用作带有基因特异性引物的标准 PCR 的模板。 PCR 扩增 cDNA，产生足够的 DNA，以便在凝胶上可视化或通过 qPCR 进行定量。
4、检测
扩增的 PCR 产物通过[琼脂糖凝胶电泳](/guides/agarose-gel- electrophoresis.html) 进行分析。预期大小的条带的存在证实了目标 RNA 存在于原始样品中。
- 应用
RT-PCR 广泛用于测量基因表达水平、检测 HIV 和 SARS-CoV-2 等 RNA 病毒、验证 RNA 测序 数据以及分析选择性剪接。当与 qPCR 结合时，它就成为 RT-qPCR，可以实时定量 RNA。
实用 RT-PCR 实验方案
首先使用硅胶柱或基于 TRIzol 的方法提取总 RNA。通过琼脂糖凝胶电泳或生物分析仪评估 RNA 完整性 - 完整的 RNA 显示清晰的 28S 和 18S 核糖体条带，28S:18S 比例接近 2:1。通过紫外分光光度法测量浓度和纯度（A260/A280 > 1.8，A260/A230 > 2.0）。将 1–5 µg RNA 用 DNase I 在 37°C 下处理 30 分钟，然后在 75°C 下热灭活 10 分钟。对于逆转录，将 DNase 处理的 RNA 与随机六聚体或寡聚 dT 引物 (50–250 ng)、1 mM dNTP 和 200 U 逆转录酶在提供的缓冲液中混合。 25°C 孵育 10 分钟，42°C 孵育 50 分钟，70°C 孵育 15 分钟。 PCR 扩增前将所得 cDNA 稀释 5-10 倍。始终包含无逆转录酶对照 (no-RT) 来检测基因组 DNA 污染 - 如果无 RT 样本产生 PCR 产物，则存在残留 DNA。对于基因特异性引物，将其设计为跨越外显子-外显子连接处，以避免扩增基因组 DNA；一个外显子上的正向引物和下游外显子上的反向引物确保仅扩增剪接的 cDNA。
实际应用
在 SARS-CoV-2 诊断中，RT-PCR 使用 CDC 或 WHO 引物探针组靶向病毒 N、E 和 RdRp 基因。从鼻咽拭子中提取 RNA，并使用双标记探针的 RT-qPCR 检测循环阈值 (Ct) 低于 40 的病毒 RNA。三个基因目标中的两个出现阳性结果可确认感染。包含内部对照（例如人 RNase P）可验证样品充足性和提取成功，防止因样品采集不当而出现假阴性。
