概述

自上而下的蛋白质组学通过质谱分析完整蛋白质，无需事先进行酶消化。与从肽推断蛋白质身份的传统自下而上方法不同，自上而下蛋白质组学测量蛋白质的完整质量，然后在质谱仪内将其片段化以获得序列信息。这种方法保留了完整的蛋白质背景，这意味着翻译后修饰、序列变异和选择性剪接形式的组合（统称为蛋白质形式）被观察为不同的分子种类。因此，自上而下的蛋白质组学提供了蛋白质形态景观的直接且明确的视图，而自下而上的方法在很大程度上是不可见的。

方法

通过电喷雾电离将完整的蛋白质离子引入质谱仪，产生电荷态包络，从中计算分子质量。 断裂是使用电子捕获解离 (ECD) 或电子转移解离 (ETD) 等技术实现的，这些技术优先裂解蛋白质主链，同时保留磷酸化和糖基化等不稳定修饰。 蛋白质形式识别依赖于将测量的完整质量和碎片离子与预测蛋白质形式数据库相匹配的算法。超高分辨率质谱仪，例如傅里叶变换离子回旋共振 (FT-ICR) 和 Orbitrap 仪器，对于解决相关蛋白质形式之间的微小质量差异至关重要。

实用协议

实用的自上而下的蛋白质组学工作流程首先在变性条件下使用 8 M 尿素或 5% SDS 提取完整蛋白质，以确保完全溶解。使用反相 HPLC 或毛细管区带电泳 (CZE)，通过电喷雾电离与高分辨率 Orbitrap 或 FT-ICR 质谱仪结合，在完整水平上分离蛋白质。该仪器可在较宽的质量范围 (m/z 400–2,000) 内进行完整的 MS 扫描，为每种蛋白质生成电荷态包络。研究人员使用 MS-Deconv 或 UniDec 等算法对包络进行解卷积，以亚 Da 精度计算中性单同位素质量。对于碎片化，使用电子转移解离 (ETD) 分离和解离最丰富的电荷态，从而保留磷酸化和糖基化等不稳定修饰。使用 ProSightPC 或 TopPIC 在预测蛋白质型数据库中搜索所得碎片光谱，将完整质量和碎片离子与由序列、修饰和序列变体定义的特定蛋白质型相匹配。通过比较不同条件下电荷态包络的相对强度来进行量化。在一项具有里程碑意义的研究中，自上而下的蛋白质组学表征了来自人类细胞的 3,000 多种蛋白质形式，其中包括 150 种不同的组蛋白 H4 蛋白，每种蛋白质都携带不同的甲基化和乙酰化标记组合。另一个应用是抗体蛋白质形式的分析：自上而下的 MS 从单个生产批次中揭示了 100 多种不同的单克隆抗体变体，从而实现生物制药生产中的质量控制并确保治疗性抗体的批次间一致性。

应用程序

自上而下的蛋白质组学擅长表征翻译后修饰 及其在单个蛋白质上的组合模式。它用于研究组蛋白修饰代码、抗体异质性和蛋白质降解产物。该方法补充了自下而上的蛋白质组学和质谱，并受益于相同的质谱仪器，同时提供对蛋白质生物学的独特见解，这对于理解疾病机制和开发精准疗法至关重要。