El espectrofotómetro es el instrumento más común en cualquier laboratorio. Mide cuánta luz absorbe una muestra a una longitud de onda dada, lo cual es proporcional a la concentración de la especie absorbente.

La Ley de Beer-Lambert

La relación fundamental es:

A = ε × b × c

donde A es la absorbancia (sin unidades), ε es la absortividad molar (L·mol⁻¹·cm⁻¹), b es la longitud del camino (cm), y c es la concentración (mol/L). La ley se cumple para soluciones diluidas (típicamente A < 1.5). A concentraciones más altas, ocurren desviaciones debido a interacciones moleculares y luz dispersa instrumental.

Componentes del Instrumento

• Fuente de luz: lámpara de deuterio para UV (190–350 nm), lámpara de tungsteno-halógeno para visible (350–900 nm). Las lámparas de flash de xenón se utilizan en algunos instrumentos modernos.
• Monocromador: una rejilla o prisma que selecciona una banda estrecha de longitudes de onda. El ancho de banda afecta la calidad de la medición — un ancho de banda más estrecho proporciona mejor linealidad.
• Compartimento de muestra: sostiene la cubeta. La mayoría de los instrumentos aceptan cubetas de 1 cm de paso. Las cubetas son de cuarzo (para UV) o vidrio/plástico (solo para visible).
• Detector: un tubo fotomultiplicador o fotodiodo que convierte la luz transmitida en una señal eléctrica.

Pasos de Operación

1. Encienda el instrumento y permita que la fuente de luz se caliente (15–30 minutos para lámparas de deuterio).
2. Seleccione la longitud de onda de medición.
3. Llene una cubeta con la solución blanco (el disolvente sin analito).
4. Coloque el blanco en el portamuestras y ajuste la absorbancia a cero (autocero).
5. Mida la muestra y registre la absorbancia.
6. Para múltiples muestras, reajuste el cero con el blanco periódicamente.

Manejo de Cubetas

Manipule las cubetas por los lados esmerilados o estriados — las huellas dactilares en las ventanas ópticas dispersan la luz y aumentan la absorbancia. Enjuague las cubetas con la solución de muestra antes de llenar. Asegúrese de que no haya burbujas en el camino de la luz.

Aplicaciones Comunes

• Cuantificación de ácidos nucleicos: medición de A₂₆₀ (1 DO₂₆₀ ≈ 50 µg/mL de ADNdc, 40 µg/mL de ARN, 33 µg/mL de ADNmc). Pureza evaluada por la relación A₂₆₀/A₂₈₀ (≈1.8 para ADN puro, ≈2.0 para ARN puro).
• Cuantificación de proteínas: los ensayos Bradford, BCA y Lowry utilizan espectrofotometría visible.
• Cinética enzimática: monitoreo continuo del consumo de NADH a 340 nm o formación de producto a una longitud de onda específica.
• Curvas de crecimiento bacteriano: turbidez medida a 600 nm (DO₆₀₀).
• Ensayos químicos colorimétricos: casi cualquier analito puede medirse si reacciona para formar un producto coloreado.