Colony PCR merupakan teknik screening cepat yang digunakan untuk mengetahui apakah koloni bakteri mengandung plasmid dengan sisipan DNA yang benar. Daripada memurnikan DNA plasmid dari setiap koloni terlebih dahulu, PCR dilakukan secara langsung pada sejumlah kecil sel bakteri.
Cara Kerja PCR Koloni
- Seleksi Koloni
Koloni bakteri individu yang tumbuh pada cawan agar diambil menggunakan ujung pipet steril atau tusuk gigi. Setiap koloni disentuh sebentar, mentransfer sejumlah kecil sel. Ujung yang sama digunakan untuk menginokulasi tabung PCR dan pelat induk untuk kultur selanjutnya.
- Lisis Sel
Sel bakteri dipanaskan hingga 95°C selama beberapa menit selama langkah denaturasi awal PCR. Perlakuan panas ini melisiskan sel, melepaskan DNA plasmid ke dalam campuran reaksi. DNA yang dibebaskan kemudian berfungsi sebagai cetakan untuk amplifikasi.
- Amplifikasi PCR
Primer yang mengapit daerah penyisipan di plasmid digunakan. Jika koloni berisi plasmid dengan sisipan yang benar, PCR akan menghasilkan pita dengan ukuran yang diharapkan. Jika plasmidnya kosong (tidak ada sisipan), pitanya akan mengecil. Jika koloni tidak mengandung plasmid sama sekali, maka tidak akan terbentuk pita.
- Analisis Gel
Produk PCR dianalisis dengan elektroforesis gel agarosa. Koloni yang menghasilkan pita dengan ukuran sisipan yang diharapkan diidentifikasi sebagai koloni positif. Koloni ini kemudian dapat ditumbuhkan untuk pemurnian plasmid dan analisis lebih lanjut.
- Keuntungan
PCR Koloni cepat dan murah, memungkinkan puluhan koloni disaring dalam beberapa jam. Hal ini menghilangkan kebutuhan akan pemurnian plasmid sebelum penyaringan dan merupakan langkah standar pertama dalam alur kerja kloning molekul.
Protokol PCR Koloni Praktis
Ambil masing-masing koloni bakteri dari cawan agar selektif menggunakan ujung pipet 10 µL steril. Sentuh satu koloni dengan ringan — hindari memindahkan sel dalam jumlah besar. Letakkan ujungnya pada master plate yang baru (LB-agar yang telah ditaburi antibiotik) untuk mengawetkan klon, lalu celupkan dan putar ujung yang sama ke dalam tabung PCR yang berisi 20–25 µL campuran master. Untuk setiap koloni, siapkan campuran: 12,5 µL 2× campuran master PCR, 0,5 µL masing-masing primer maju dan mundur (10 µM), 1 µL templat (koloni), dan air hingga 25 µL. Gunakan primer khusus vektor yang mengapit sisipan (misalnya M13 maju/mundur atau T7/SP6) atau primer internal khusus sisipan. Jalankan PCR dengan denaturasi awal yang diperpanjang pada suhu 95°C selama 5–10 menit untuk memastikan lisis bakteri dan pelepasan DNA secara menyeluruh. Dilanjutkan dengan 30–35 siklus 95°C selama 30 detik, 55°C selama 30 detik, dan 72°C selama 1 menit per kb penyisipan yang diharapkan, dengan ekstensi akhir pada 72°C selama 5 menit. Analisis 5–10 μL setiap reaksi dengan elektroforesis gel agarosa. Pita pada ukuran sisipan yang diharapkan menunjukkan klon positif. Jika tidak ada pita yang muncul, koloni mungkin kekurangan plasmid, mengandung vektor kosong (menghasilkan pita lebih kecil), atau lisis tidak mencukupi – mengurangi jumlah sel bakteri yang ditransfer. Untuk bakteri Gram positif yang membandel, tambahkan 0,5 µL lisozim (50 mg/mL) ke dalam campuran PCR atau lakukan lisis beku-cair sebelum PCR.
Aplikasi Dunia Nyata
Saat mengkloning kaset ekspresi GFP 1,2 kb menjadi pET-28a, transforman disepuh pada agar kanamisin. Dari 24 koloni yang disaring oleh koloni PCR dengan primer promotor dan terminator T7, 18 menunjukkan pita 1,2 kb, 4 menunjukkan pita vektor kosong (300 bp), dan 2 tidak menghasilkan pita. 18 klon positif digunakan untuk pemurnian dan pengurutan plasmid, memastikan keberhasilan kloning dalam waktu kurang dari 4 jam.
