Pemurnian plasmid, juga dikenal sebagai miniprep, adalah teknik yang digunakan untuk mengisolasi molekul DNA melingkar kecil (plasmid) dari sel bakteri. Plasmid biasanya digunakan sebagai vektor dalam kloning molekul, dan memurnikannya sangat penting untuk pengurutan, transfeksi, dan manipulasi lebih lanjut.
Cara Kerja Pemurnian Plasmid
- Kultur Bakteri
Sebuah koloni bakteri tunggal yang mengandung plasmid yang diinginkan ditumbuhkan semalaman dalam media cair dengan antibiotik yang sesuai. Hal ini memastikan bakteri mempertahankan plasmid dan menghasilkan cukup untuk ekstraksi.
- Pemanenan dan Lisis Sel
Kultur bakteri disentrifugasi untuk membuat pelet sel. Pelet diresuspensi dalam buffer yang mengandung RNase (untuk mencerna RNA) dan kemudian diolah dengan larutan lisis basa yang mengandung SDS dan natrium hidroksida. Ini memecah sel dan mengubah sifat DNA.
- Netralisasi
Buffer netralisasi yang mengandung kalium asetat ditambahkan. Konsentrasi garam yang tinggi menyebabkan DNA kromosom dan protein yang terdenaturasi mengendap, sedangkan DNA plasmid superkoil yang lebih kecil tetap berada dalam larutan. Campuran disentrifugasi, dan supernatan yang mengandung plasmid dikumpulkan.
- Mengikat dan Mencuci
Supernatan dilewatkan melalui kolom membran silika dalam kondisi yang menyebabkan DNA plasmid berikatan. Buffer pencuci menghilangkan sisa kontaminan seperti garam, protein, dan RNA.
- Elusi
DNA plasmid yang telah dimurnikan dilepaskan dari membran menggunakan buffer rendah garam atau air. DNA yang dihasilkan cukup murni untuk pengurutan, pembatasan pencernaan, atau transfeksi sel eukariotik.
Protokol Miniprep Praktis (Lisis Alkaline)
Inokulasi satu koloni bakteri ke dalam 3–5 mL media LB dengan antibiotik yang sesuai dan inkubasi pada suhu 37°C dengan pengocokan pada 220 rpm selama 12–16 jam. Panen sel dengan menyentrifugasi 1,5–2 mL kultur pada 8.000 × g selama 2 menit. Buang supernatan dan resuspensi pelet dalam 250 µL buffer resuspensi (P1, mengandung 50 mM Tris-HCl pH 8,0, 10 mM EDTA, dan 100 µg/mL RNase A). Tambahkan 250 µL buffer lisis (P2, 200 mM NaOH, 1% SDS), aduk perlahan dengan membalik 4–6 kali, dan inkubasi pada suhu kamar selama 3 menit — jangan divorteks atau melebihi 5 menit. Tambahkan 350 µL buffer netralisasi (P3, 3 M kalium asetat pH 5,5), segera aduk dengan cara dibalik, dan inkubasi dalam es selama 5 menit. Centrifuge pada 13.000 × g selama 10 menit. Pindahkan supernatan bening ke kolom membran silika. Centrifuge pada 13.000 × g selama 1 menit, buang flow-through. Cuci dengan 750 µL buffer pencuci (mengandung etanol) dan sentrifugasi selama 1 menit. Ulangi dengan pencucian kedua. Keringkan kolom dengan cara disentrifugasi selama 2 menit. Elusi DNA dalam 30–50 µL buffer elusi (10 mM Tris-HCl pH 8,5) atau air bebas nuklease dengan cara disentrifugasi selama 1 menit setelah inkubasi 2 menit. Nilai hasil dengan spektrofotometri UV — kultur 5 mL biasanya menghasilkan 5–15 µg DNA plasmid dengan A260/A280 > 1,8 dan A260/A230 > 2,0. Untuk plasmid dengan salinan rendah, tingkatkan volume kultur hingga 10 mL atau gunakan kit pemurnian khusus salinan rendah.
Aplikasi Dunia Nyata
Setelah mengkloning insert 1,5 kb ke pET-28a, 6 koloni positif ditumbuhkan untuk miniprep. Pembacaan A260 menunjukkan hasil 8–12 µg per persiapan. Pembatasan pencernaan dengan NcoI dan XhoI mengkonfirmasi penyisipan di keenam sampel. Plasmid yang telah dimurnikan dikirim untuk pengurutan Sanger, menghasilkan kromatogram berkualitas tinggi tanpa kebisingan latar belakang.
