PCR Kuantitatif (qPCR), juga dikenal sebagai PCR waktu nyata, adalah teknik laboratorium yang memperkuat dan sekaligus mengkuantifikasi DNA secara waktu nyata. Berbeda dengan PCR, yang hanya menampilkan jumlah akhir DNA, qPCR memantau akumulasi DNA selama reaksi menggunakan fluoresensi.
Cara Kerja qPCR
- Pengaturan Reaksi
Reaksi tersebut mengandung komponen yang sama seperti PCR konvensional—DNA templat, primer, DNA polimerase, dan nukleotida—ditambah reporter fluoresen. Dua sistem reporter yang umum adalah SYBR Green, pewarna yang berfluoresensi ketika terikat pada DNA beruntai ganda, dan probe TaqMan, yang merupakan probe fluoresen spesifik urutan.
- Amplifikasi dan Deteksi
Reaksi mengalami siklus termal yang sama seperti PCR standar: denaturasi, anil, dan ekstensi. Setelah setiap siklus, pengukuran fluoresensi dilakukan. Semakin banyak DNA yang diamplifikasi, sinyal fluoresensi meningkat secara proporsional.
- Nilai Ct
Siklus ambang batas (Ct) adalah nomor siklus di mana sinyal fluoresensi naik melebihi tingkat latar belakang. Nilai Ct berbanding terbalik dengan jumlah awal DNA target: lebih banyak DNA awal berarti lebih sedikit siklus yang diperlukan untuk mencapai ambang batas.
- Kuantifikasi
Kuantifikasi absolut menggunakan kurva standar konsentrasi DNA yang diketahui untuk menghitung jumlah pasti DNA target. Kuantifikasi relatif membandingkan nilai Ct gen target dengan gen referensi, menentukan perubahan ekspresi.
- Analisis Kurva Leleh
Ketika SYBR Green digunakan, analisis kurva leleh dilakukan setelah amplifikasi. DNA dipanaskan secara perlahan sementara fluoresensi dipantau. Setiap produk DNA meleleh pada suhu yang khas, memastikan bahwa amplikon yang benar telah dihasilkan dan tidak ada dimer primer.
Protokol qPCR Praktis
Siapkan reaksi dalam cawan 96 lubang atau 384 lubang. Untuk SYBR Green, campurkan 5 µL dari 2× campuran master SYBR Green, 0,5 µL setiap primer (10 µM), 2 µL template cDNA atau DNA, dan air hingga 10 µL. Untuk deteksi berbasis probe, ganti SYBR Green dengan campuran master probe 2× dan tambahkan 0,2–0,4 µM pada setiap probe. Tutup pelat dengan film perekat optik dan sentrifugasi sebentar. Jalankan pada cycler real-time dengan program berikut: 95°C selama 2 menit (aktivasi polimerase), kemudian 40 siklus 95°C selama 15 detik dan 60°C selama 30–60 detik (anil dan ekstensi). Kumpulkan data fluoresensi pada akhir setiap langkah perluasan. Setelah bersepeda, lakukan jalur kurva leleh dari 60°C ke 95°C jika menggunakan SYBR Green. Untuk kuantifikasi absolut, siapkan kurva standar dengan mengencerkan templat yang diketahui secara serial (10^7 hingga 10^2 salinan/µL dalam langkah 10 kali lipat). Plot Ct vs. nomor salinan log dan verifikasi kemiringannya antara −3.1 dan −3.6 (efisiensi 90–110%). Untuk kuantifikasi relatif menggunakan metode ΔΔCq, hitung ΔCt = Ct(target) − Ct(referensi), lalu ΔΔCt = ΔCt(diperlakukan) − ΔCt(kontrol). Perubahan lipatan = 2^(−ΔΔCt). Sertakan kontrol tanpa templat dan kontrol tanpa RT untuk target berbasis RNA. Jalankan semua sampel dalam rangkap tiga teknis dan buang semua sampel dengan deviasi standar Ct > 0,5.
Aplikasi Dunia Nyata
Dalam studi ekspresi gen untuk penelitian kanker, RT-qPCR dengan SYBR Green mengukur tingkat mRNA onkogen seperti MYC dan penekan tumor seperti TP53. GAPDH atau ACTB berfungsi sebagai gen referensi. RNA dari tumor dan jaringan normal di sekitarnya ditranskripsi terbalik, dan analisis ΔΔCq menunjukkan bahwa MYC diregulasi 8,5 kali lipat pada tumor (p <0,001). Analisis kurva leleh mengkonfirmasi produk tunggal pada Tm yang diharapkan, mengesampingkan artefak primer-dimer.
