Pengurutan RNA (RNA-Seq) adalah teknik yang menggunakan pengurutan generasi berikutnya untuk menganalisis rangkaian lengkap transkrip RNA dalam sampel sel atau jaringan. Ini memberikan gambaran ekspresi gen, mengungkapkan gen mana yang aktif dan pada tingkat apa.
Cara Kerja RNA-Seq
- Ekstraksi RNA
Total RNA diekstraksi dari sampel menggunakan metode yang mirip dengan isolasi DNA, tetapi dengan langkah tambahan untuk mengawetkan molekul RNA yang rapuh. Integritas RNA diperiksa menggunakan elektroforesis gel atau bioanalyzer.
- Pengayaan mRNA atau Deplesi rRNA
Karena RNA ribosom merupakan sebagian besar dari total RNA, maka RNA tersebut dihilangkan untuk memperkaya messenger RNA (mRNA). Hal ini dilakukan dengan menggunakan manik-manik poli-T yang menangkap ekor poli-A mRNA, atau dengan secara selektif menghabiskan rangkaian RNA ribosom.
- Persiapan Perpustakaan
MRNA yang diperkaya difragmentasi menjadi potongan-potongan kecil dan ditranskripsi terbalik menjadi DNA komplementer (cDNA) menggunakan primer acak. Adaptor diikat ke fragmen cDNA, dan pustakanya diperkuat oleh PCR.
- Urutan
Pustaka cDNA diurutkan pada platform NGS, menghasilkan jutaan bacaan singkat. Setiap pembacaan mewakili urutan pendek dari salah satu ujung fragmen cDNA.
- Analisis Data
Pembacaannya selaras dengan genom referensi atau transkriptom. Jumlah pemetaan pembacaan untuk setiap gen dihitung untuk mengukur tingkat ekspresi. Analisis ekspresi diferensial mengidentifikasi gen yang secara signifikan diatur naik atau turun antar kondisi.
- Aplikasi
RNA-Seq digunakan untuk mempelajari perubahan ekspresi gen dalam perkembangan, penyakit, pengobatan, dan respons lingkungan. Ia juga dapat mendeteksi penyambungan alternatif, transkrip baru, dan RNA non-coding.
Protokol RNA-Seq Praktis
Ekstrak total RNA menggunakan TRIzol atau metode berbasis kolom dengan perlakuan DNase dalam kolom. Menilai integritas RNA pada Bioanalyzer atau TapeStation — Nomor Integritas RNA (RIN) > 7 diperlukan untuk mRNA-Seq, sedangkan > 5 mungkin cukup untuk total RNA-Seq dengan penipisan rRNA. Untuk pengayaan mRNA, inkubasi 0,1–1 µg RNA total dengan manik magnetik yang menempel pada poli-T oligo untuk menangkap mRNA poli-adenilasi. Alternatifnya, gunakan kit Ribo-Zero untuk menghabiskan rRNA sitoplasma dan mitokondria. Fragment mRNA yang diperkaya dengan inkubasi pada suhu 94°C selama 8 menit dalam buffer fragmentasi, menghasilkan ~200 nt fragmen. Sintesis cDNA untai pertama menggunakan heksamer acak dan transkriptase balik pada suhu 25°C selama 10 menit, 42°C selama 50 menit, dan 70°C selama 15 menit. Ganti untai RNA dengan dUTP selama sintesis untai kedua untuk mengaktifkan spesifisitas untai — untai kedua yang mengandung dUTP akan terdegradasi secara selektif selama amplifikasi perpustakaan. Lakukan perbaikan akhir, A-tailing, dan ligasi adaptor seperti pada persiapan perpustakaan NGS standar. Degradasi untai kedua berlabel dUTP menggunakan enzim USER sebelum pengayaan PCR (10–15 siklus). Urutkan perpustakaan akhir pada platform Illumina yang menghasilkan 20–40 juta pembacaan berpasangan per sampel (2 × 75 bp atau 2 × 150 bp). Memproses file FASTQ mentah melalui jalur bioinformatika: pemangkasan kualitas dengan cutadapt, menyelaraskan dengan genom referensi menggunakan STAR (mode 2-pass untuk sambungan sambungan baru), mengukur jumlah tingkat gen dengan featureCounts atau HTSeq, dan mengidentifikasi gen yang diekspresikan secara berbeda dengan DESeq2 atau edgeR menggunakan ambang batas tingkat penemuan palsu sebesar 0,05. Sertakan setidaknya tiga ulangan biologis per kondisi untuk kekuatan statistik.
Aplikasi Dunia Nyata
Dalam sebuah penelitian yang membandingkan hepatosit yang diobati dengan hepatosit kontrol, RNA-Seq mengidentifikasi 1.247 gen yang diekspresikan secara berbeda (FDR <0,05). Analisis pengayaan jalur mengungkapkan peningkatan regulasi gen metabolisme lipid dan penurunan regulasi jalur inflamasi. Data divalidasi oleh RT-qPCR pada 10 gen terpilih, memastikan arah dan besarnya perubahan lipatan.
