菌落 PCR 是一种快速筛选技术，用于确定细菌菌落是否含有带有正确 DNA 插入片段的质粒。 PCR 不是首先从每个菌落中纯化质粒 DNA，而是直接在少量细菌细胞上进行。
菌落 PCR 的工作原理
- 菌落选择
使用无菌移液器吸头或牙签挑取琼脂平板上生长的单个细菌菌落。每个集落被短暂接触，转移少量细胞。使用相同的尖端来接种 PCR 管和主板以供后续培养。
- 细胞裂解
在 PCR 的初始变性步骤中，细菌细胞被加热至 95°C 几分钟。这种热处理裂解细胞，将质粒 DNA 释放到反应混合物中。然后释放的 DNA 作为扩增模板。
- PCR 扩增
使用质粒中插入区域侧翼的引物。如果菌落含有带有正确插入片段的质粒，PCR 将产生预期大小的条带。如果质粒为空（无插入片段），则条带会更小。如果菌落根本不含质粒，则不会产生条带。
- 凝胶分析
PCR 产物通过[琼脂糖凝胶电泳](/guides/agarose-gel- electrophoresis.html) 进行分析。产生预期插入片段大小条带的集落被鉴定为阳性。然后可以培养这些菌落以进行质粒纯化 和进一步分析。
5、优点
菌落 PCR 快速且廉价，可在几个小时内筛选出数十个菌落。它消除了筛选前纯化质粒的需要，是分子克隆工作流程中标准的第一步。
实用菌落 PCR 实验方案
使用无菌 10 µL 移液器吸头从选择性琼脂板中挑选单个细菌菌落。轻轻触摸单个集落——避免转移大团细胞。将吸头划线到新鲜的母板（带有抗生素的网格 LB 琼脂）上以保存克隆，然后将同一吸头浸入并旋转到含有 20-25 µL 主混合物的 PCR 管中。对于每个菌落，准备混合物：12.5 µL 2× PCR 主混合物、正向和反向引物各 0.5 µL (10 µM)、1 µL 模板（菌落）和水至 25 µL。使用插入片段侧翼的载体特异性引物（例如，M13 正向/反向或 T7/SP6）或插入片段特异性内部引物。在 95°C 下运行 PCR，延长初始变性 5-10 分钟，以确保细菌完全裂解和 DNA 释放。随后对每 kb 预期插入片段进行 95°C 30 秒、55°C 30 秒和 72°C 1 分钟 30-35 个循环，最后在 72°C 延伸 5 分钟。通过琼脂糖凝胶电泳分析每个反应的 5–10 µL。预期插入片段大小的条带表示阳性克隆。如果没有出现条带，则菌落可能缺少质粒，包含空载体（产生较小的条带），或者裂解不充分 - 减少转移的细菌细胞量。对于顽固的革兰氏阳性细菌，在 PCR 混合物中添加 0.5 µL 溶菌酶 (50 mg/mL) 或在 PCR 之前进行冻融裂解。
实际应用
将 1.2 kb GFP 表达盒克隆到 pET-28a 中时，将转化体铺在卡那霉素琼脂上。使用 T7 启动子和终止子引物通过菌落 PCR 筛选的 24 个菌落中，18 个显示 1.2 kb 条带，4 个显示空载体条带（300 bp），2 个不产生条带。 18 个阳性克隆用于质粒纯化和测序，在 4 小时内确认克隆成功。
