荧光光谱是一种测量光子激发后分子发射光的分析技术。它具有高灵敏度（检测限低至 pM）、选择性强，广泛应用于生物化学、环境分析和材料科学。

荧光原理

分子吸收光子并从基态 (S0) 提升到激发单线态 (S1 或 S2)。内部转换迅速将分子松弛到 S1 的最低振动能级（卡莎法则）。当分子通过发射光子返回到 S0 时，就会产生荧光，并且发射的光比吸收的光具有更长的波长（更低的能量），这种现象称为斯托克斯位移。这种位移是由振动弛豫和溶剂重组造成的能量损失引起的，大的斯托克斯位移（20-100 nm）允许通过滤光片或单色仪分离激发光和发射光。雅布隆斯基图说明了这些光物理过程：吸收、内转换、荧光、系间窜越和磷光。

荧光参数

关键荧光参数包括量子产率、寿命和强度。量子产率 (Φ) 是发射的光子与吸收的光子的比率（Φ = kemited/kabsorbed），其值范围从小于 0.01（弱荧光）到接近 1.0（强荧光，例如 pH 9 时的荧光素，Φ = 0.95）。寿命 (τ) 是分子在发射光子之前处于激发态的平均时间，对于有机荧光团通常为 1-10 ns。荧光强度遵循 I = I0 × (1 - 10-εbc) × Φ，其中 ε 为摩尔吸光系数，b 为光程长度，c 为浓度；在低浓度下，强度与浓度成正比。

荧光团

荧光团分为内在荧光团和外在荧光团。内在荧光团是天然存在的荧光分子，例如芳香族氨基酸（色氨酸，λex ~280 nm，λem ~350 nm）、NADH、黄素和叶绿素。外源荧光团是添加到非荧光样品中的合成染料，包括荧光素（λex 494 nm、λem 518 nm）、罗丹明、花青染料（Cy3、Cy5）和 Alexa Fluor 系列。量子点是具有尺寸可调发射、宽激发、窄发射和高光稳定性的半导体纳米晶体。

仪器仪表

荧光光谱仪包括用于稳态测量的氙弧灯（广谱，200-1000 nm）或 LED 等光源，以及用于时间分辨测量的脉冲激光器或 LED。激发单色仪选择激发波长，双单色仪减少杂散光以进行高灵敏度测量。样品室使用四面透明石英比色皿，用于直角检测几何形状，或用于高吸收或散射样品的正面几何形状。发射单色仪扫描发射波长，而长通滤光片阻挡散射的激发光，检测器通常是用于高灵敏度的光电倍增管 (PMT) 或用于多通道检测的 CCD。

荧光技术

存在几种专门的荧光技术。稳态荧光测量固定激发波长下的发射强度，用于浓度测定和发射光谱表征。时间分辨荧光测量短激发脉冲后的荧光衰减，用于确定荧光寿命、区分动态和静态猝灭以及研究分子动力学。荧光共振能量转移 (FRET) 涉及 1-10 nm 范围内从供体荧光团到受体的非辐射能量转移，效率与 1/r6 成正比，使其成为蛋白质和核酸距离的分子标尺。荧光偏振（各向异性）测量荧光团的旋转迁移率，用于结合研究和免疫测定。

淬火

荧光猝灭可以通过两种机制发生。当 O2、I- 或丙烯酰胺等猝灭剂在激发态期间扩散到荧光团并与荧光团碰撞时，就会发生动态（碰撞）猝灭，如 Stern-Volmer 方程所示：F0/F = 1 + KSV[Q]。当猝灭剂与荧光团形成非荧光基态复合物时，就会发生静态猝灭。这两种机制通过寿命测量来区分：动态淬火会缩短寿命，而静态淬火则不会。

应用程序

荧光光谱用于药物和环境样品中荧光分析物的定量分析、使用荧光底物的酶活性测定、使用荧光标记的DNA测序和微阵列分析、使用荧光抗体和染料的细胞成像和流式细胞术以及多环芳烃和腐殖质等污染物的环境监测。