原位杂交 (ISH) 是一种使用标记的核酸探针直接检测组织切片或细胞学制剂中特定 DNA 或 RNA 序列的技术。与基于提取的分子方法（PCR、测序）不同，ISH 保留了组织结构并准确显示哪些细胞包含目标序列。

原则

ISH 使用探针：与目标序列互补的单链 DNA 或 RNA 分子。探针标有可检测标记（放射性同位素、荧光团、半抗原）。目标 DNA 变性（对于 DNA ISH）或未变性（对于 RNA ISH）后，探针在受控温度和盐条件下与目标序列杂交。未结合的探针被洗掉，结合的探针通过放射自显影、荧光显微镜或基于酶的显色检测来检测。

严格性： 杂交的特异性由温度和盐浓度控制。高严格性（高温、低盐）仅允许形成完美匹配的探针-靶标杂交体。较低的严格性允许部分错配，这对于检测相关序列可能是理想的，但会增加背景。

荧光原位杂交 (FISH)

FISH 使用通过荧光显微镜检测的荧光团标记探针。它是诊断病理学中应用最广泛的 ISH 方法。 FISH 探针包括： 着丝粒计数探针 (CEP)： 着丝粒中的目标染色体特异性 α 卫星 DNA，用于检测非整倍体； 位点特异性指示探针 (LSI)： 针对特定染色体位点的独特序列，用于检测基因扩增（HER2、EGFR）和缺失（少突胶质细胞瘤中的 1p/19q）； 分离探针： 位于基因位点两侧的探针对；分离表明易位（ALK、ROS1、MYC、BCL2、BCL6、MALT1）； 融合探针： 易位断点的每一侧各有一个探针；融合信号表明易位。

HER2 FISH： 确定乳腺癌和胃癌 HER2 状态的金标准。 HER2 (17q12) 信号与 CEP17 信号的比率 >2.0 被放大。当 IHC 不明确（2+ 分数）时进行 FISH。

ALK FISH： 肺腺癌中 ALK (2p23) 重排的分离 FISH 可检测对 ALK 抑制剂（克唑替尼、艾来替尼）有反应的患者。 ALK IHC（D5F3 克隆）已在很大程度上取代 FISH 作为主要筛选测试，但 FISH 仍然是验证方法。

显色原位杂交 (CISH)

CISH 使用半抗原标记探针，通过基于酶的显色反应（DAB 表示棕色，Fast Red 表示红色）进行检测。该信号在明场显微镜下可见，从而可以同时评估形态和杂交信号。 CISH 比 FISH 更便宜（不需要荧光显微镜），可以产生永久性载玻片，并且更容易在常规组织病理学实验室中使用。

RNA 原位杂交

RNA ISH 可检测组织切片中的特定 mRNA 转录本。 RNAscope（高级细胞诊断）是一种市售的 RNA ISH 技术，使用探针设计策略（双 Z 探针）消除非特异性探针结合的背景。每个目标 mRNA 在细胞质（或新生转录物的细胞核）中显示为点状信号。 RNAscope 的灵敏度比传统 RNA ISH 高出 100 倍，并且可以检测每个细胞少至 1-2 个 mRNA 拷贝。

RNA ISH 的应用包括：检测病毒 RNA（EBV EBER ， 用于识别霍奇金淋巴瘤、移植后淋巴增殖性疾病、鼻咽癌中 EBV 感染细胞的标准方法）； HPV RNA（E6/E7 mRNA 检测证实转录活跃的 HPV 感染）； 基因表达分析（PD-L1 mRNA、炎症浸润中的细胞因子表达）； 谱系测定（检测低分化肿瘤中的组织特异性转录本）。

诊断应用

淋巴瘤诊断： 对弥漫性大 B 细胞淋巴瘤（双重打击和三重打击淋巴瘤）中的 MYC、BCL2 和 BCL6 易位进行 FISH。 EBER ISH 用于霍奇金淋巴瘤和移植后淋巴增殖性疾病中的 EBV。

肉瘤诊断： FISH 用于 SS18（滑膜肉瘤）、FKHR（肺泡横纹肌肉瘤）、EWSR1（尤文肉瘤、促结缔组织增生性小圆细胞瘤）和 MDM2（分化良好/去分化脂肪肉瘤）。

肺癌： ALK FISH、ROS1 FISH 和 MET 扩增 FISH 用于选择靶向治疗。

乳腺癌： HER2 FISH 用于可疑的 IHC 病例。

限制

FISH 需要荧光显微镜和用于信号计数的专用软件。 厚组织切片中的探针穿透可能不完全。 信号衰落： 长时间激发的荧光团光漂白；载玻片应避光保存。 解释挑战包括切割核（石蜡切片中的截断伪影可能会删除信号 - 使用 4 µm 切片）、重叠信号和多体性。 保存不良的组织中的 RNA 降解会导致假阴性 RNA ISH。 质量保证 包括使用已知的阳性和阴性对照进行定期验证、参与 EQA 计划以及记录解释标准。