定量 PCR (qPCR) 也称为实时 PCR，是一种实时扩增并同时定量 DNA 的实验室技术。与仅显示 DNA 最终量的传统 PCR 不同，qPCR 使用荧光监测整个反应过程中 DNA 的积累。
qPCR 的工作原理
- 反应设置
该反应包含与传统 PCR 相同的成分——模板 DNA、引物、DNA 聚合酶和核苷酸——加上荧光报告基因。两种常见的报告系统是 SYBR Green（一种与双链 DNA 结合时发出荧光的染料）和 TaqMan 探针（一种序列特异性荧光探针）。
- 扩增和检测
该反应经历与标准 PCR 相同的热循环：变性、退火和延伸。每个循环后，进行荧光测量。随着更多 DNA 被扩增，荧光信号成比例增加。
- Ct值
阈值循环 (Ct) 是荧光信号升至背景水平之上的循环数。 Ct 值与目标 DNA 的起始量成反比：起始 DNA 越多意味着达到阈值所需的循环越少。
- 量化
绝对定量使用已知 DNA 浓度的标准曲线来计算目标 DNA 的精确量。相对定量将目标基因与参考基因的 Ct 值进行比较，确定表达的倍数变化。
- 熔解曲线分析
当使用SYBR Green时，扩增后进行熔解曲线分析。 DNA 缓慢加热，同时监测荧光。每个 DNA 产物在特征温度下熔化，确认产生了正确的扩增子并且不存在引物二聚体。
实用 qPCR 实验方案
在 96 孔或 384 孔板中准备反应。对于 SYBR Green，将 5 µL 2× SYBR Green 主混合物、0.5 µL 每种引物 (10 µM)、2 µL 模板 cDNA 或 DNA 以及水混合至 10 µL。对于基于探针的检测，用 2× 探针预混液替换 SYBR Green，并添加每个探针 0.2–0.4 µM。用光学粘合膜密封板并短暂离心。使用以下程序在实时循环仪上运行：95°C 2 分钟（聚合酶激活），然后 40 个循环，95°C 15 秒，60°C 30-60 秒（退火和延伸）。在每个延伸步骤结束时收集荧光数据。循环后，如果使用 SYBR Green，则执行从 60°C 到 95°C 的熔解曲线斜坡。对于绝对定量，通过连续稀释已知模板（10^7 至 10^2 拷贝/μL，以 10 倍为步长）来准备标准曲线。绘制 Ct 与对数拷贝数的关系图，并验证斜率在 -3.1 和 -3.6 之间（90–110% 效率）。对于使用 ΔΔCq 方法进行相对定量，计算 ΔCt = Ct（目标）- Ct（参考），然后 ΔΔCt = ΔCt（处理）- ΔCt（对照）。倍数变化 = 2^(−ΔΔCt)。包括基于 RNA 的靶标的无模板对照和无 RT 对照。运行所有技术样品一式三份，并丢弃 Ct 标准偏差 > 0.5 的任何样品。
实际应用
在癌症研究的基因表达研究中，使用 SYBR Green 的 RT-qPCR 可以量化 MYC 等癌基因和 TP53 等肿瘤抑制基因的 mRNA 水平。 GAPDH 或 ACTB 作为参考基因。来自肿瘤和邻近正常组织的 RNA 被逆转录，ΔΔCq 分析表明 MYC 在肿瘤中上调 8.5 倍 (p < 0.001)。熔解曲线分析证实单一产物达到预期 Tm，排除了引物二聚体假象。
