RNA 测序 (RNA-Seq) 是一种使用新一代测序来分析细胞或组织样本中完整的 RNA 转录本的技术。它提供了基因表达的快照，揭示了哪些基因处于活跃状态以及活跃水平。
RNA 测序如何工作
1.RNA提取
使用类似于 DNA 分离的方法从样品中提取总 RNA，但需要采取额外的步骤来保存脆弱的 RNA 分子。使用凝胶电泳或生物分析仪检查 RNA 完整性。
- mRNA 富集或 rRNA 去除
由于核糖体 RNA 占总 RNA 的大部分，因此将其去除以富集信使 RNA (mRNA)。这是通过使用捕获 mRNA 聚 A 尾部的聚 T 珠或通过选择性耗尽核糖体 RNA 序列来完成的。
- 文库准备
富集的 mRNA 被片段化成小片段，并使用随机引物反转录成互补 DNA (cDNA)。将接头连接至 cDNA 片段，并通过 PCR 扩增文库。
- 测序
cDNA 文库在 NGS 平台上进行测序，生成数百万个短读数。每个读数代表 cDNA 片段一端的一段短序列。
- 数据分析
读数与参考基因组或转录组进行比对。计算映射到每个基因的读取数量以量化表达水平。差异表达分析可识别在不同条件下显着上调或下调的基因。
- 应用
RNA-Seq 用于研究发育、疾病、药物治疗和环境反应中的基因表达变化。它还可以检测选择性剪接、新转录本和非编码 RNA。
实用 RNA 测序协议
使用 TRIzol 或采用柱上 DNase 处理的柱方法提取总 RNA。在生物分析仪或 TapeStation 上评估 RNA 完整性 — mRNA-Seq 需要 RNA 完整性数 (RIN) > 7，而对于 rRNA 耗尽的总 RNA-Seq，> 5 可能就足够了。对于 mRNA 富集，将 0.1–1 µg 总 RNA 与聚 T 寡核苷酸附着的磁珠一起孵育以捕获聚腺苷酸化 mRNA。或者，使用 Ribo-Zero 试剂盒消耗细胞质和线粒体 rRNA。在片段化缓冲液中于 94°C 孵育 8 分钟，对富集的 mRNA 进行片段化，生成约 200 nt 片段。使用随机六聚体和逆转录酶在 25°C 10 分钟、42°C 50 分钟和 70°C 15 分钟下合成第一链 cDNA。在第二链合成过程中用 dUTP 替换 RNA 链，以实现链特异性 — 包含 dUTP 的第二链将在文库扩增过程中被选择性降解。按照标准 NGS 文库制备方法进行末端修复、A 加尾和接头连接。在 PCR 富集（10-15 个循环）之前，使用 USER 酶降解 dUTP 标记的第二链。在 Illumina 平台上对最终文库进行测序，每个样本生成 20-4000 万个双端读数（2 × 75 bp 或 2 × 150 bp）。通过生物信息学管道处理原始 FASTQ 文件：使用 cutadapt 进行质量修剪，使用 STAR（新型剪接点的 2 遍模式）比对到参考基因组，使用 featureCounts 或 HTSeq 量化基因水平计数，并使用 DESeq2 或 edgeR 使用 0.05 的错误发现率阈值识别差异表达的基因。每个条件至少包括三个生物重复以获得统计功效。
实际应用
在一项比较药物处理肝细胞与对照肝细胞的研究中，RNA-Seq 鉴定了 1,247 个差异表达基因 (FDR < 0.05)。通路富集分析揭示了脂质代谢基因的上调和炎症通路的下调。通过 RT-qPCR 对 10 个选定基因验证数据，确认倍数变化的方向和幅度。
