定点诱变对 DNA 序列引入特定的、有针对性的改变，从而能够研究蛋白质功能、改造具有改进特性的酶以及创建疾病模型。它是分子生物学中最重要的工具之一。

引物延伸方法

最常见的方法是使用含有所需突变的诱变寡核苷酸引物，其两侧是与目标 DNA 互补的序列。引物与单链模板退火，DNA 聚合酶将其延伸以产生完整的双链分子。原始链源自野生型模板，而新合成的链则带有突变。

针对亲本链的选择对于富集突变体是必要的。在经典的 Kunkel 方法中，模板在包含尿嘧啶而不是胸腺嘧啶的 dut ung 细菌菌株中生长。体外合成后，含尿嘧啶的模板被尿嘧啶-DNA 糖基化酶降解，使新合成的突变链保持完整。商业试剂盒使用 DpnI 限制性内切酶 来切割甲基化 DNA，消化细菌衍生的模板，同时留下含有突变的体外合成链。

基于 PCR 的诱变

重叠延伸 PCR 使用两轮扩增。在第一轮中，两个单独的 PCR 反应扩增目标基因的重叠片段。一对引物包含突变，并且片段末端在突变位点处重叠。在第二轮中，将两个片段混合并用作带有外部引物的 PCR 模板，产生包含突变的全长产物。该方法需要仔细的引物设计，但效率很高，并且不需要单链模板。

全质粒诱变在双链质粒模板上使用一对互补诱变引物。高保真 DNA 聚合酶在 PCR 反应中扩增整个质粒，并用 DpnI 消化甲基化模板。反应物被转化到大肠杆菌中，其中带切口的环状 DNA 被修复。该方法简单，广泛用于引入点突变、插入和缺失。

蛋白质工程中的应用

定点诱变允许对蛋白质结构-功能关系进行系统研究。丙氨酸扫描将感兴趣区域中的每个残基突变为丙氨酸，去除β碳以外的侧链。对突变蛋白的分析揭示了哪些残基对功能很重要。这种方法已用于绘制酶活性位点图、识别配体结合残基以及确定单个氨基酸对蛋白质稳定性的贡献。

盒式诱变用包含随机序列的合成寡核苷酸盒替换基因的一小段。饱和诱变在选定位置引入所有可能的氨基酸取代，创建可筛选改进功能的文库。定向进化将随机诱变与选择或筛选相结合，产生具有增强特性的蛋白质，例如增加的热稳定性、改变的底物特异性或改进的催化活性。

疾病建模

定点诱变用于创建人类遗传疾病的动物模型。 CRISPR-Cas9系统极大地加速了这一过程，允许将特定突变引入小鼠、大鼠、斑马鱼和其他生物体的基因组中。这些模型概括了人类疾病表型，用于研究疾病机制和测试潜在的疗法。可以引入与患者中发现的点突变相对应的点突变来研究基因型-表型相关性。

限制

定点诱变可以产生意想不到的结果。预期的突变可能会影响蛋白质折叠，而不是影响正在研究的特定功能。突变会以不可预测的方式破坏局部结构，对突变表型的解释必须考虑间接影响。对照实验，例如以野生型水平表达突变蛋白并通过圆二色性或其他方法确认正确折叠，对于严格的解释至关重要。

盒式诱变和基因合成

现代基因合成可以降低成本生产定制 DNA 序列，无需基于 PCR 的方法即可产生大量突变体。可以用优化的密码子、引入的限制性位点和多个突变来设计合成基因。组合文库可以通过组装合成寡核苷酸来产生。这种方法越来越多地取代传统的定点诱变，用于需要多种变体的应用，例如工程抗体或优化代谢途径。