概述

靶向蛋白质组学侧重于以高灵敏度、特异性和通量对一组预定义的蛋白质进行定量，这与旨在广泛、非靶向覆盖的发现蛋白质组学相反。最广泛采用的技术是在三重四极杆质谱仪上执行的选择反应监测（SRM，也称为多反应监测或 MRM）。 SRM 检测针对特定的肽前体到片段的转变，称为蛋白肽，它唯一地代表了感兴趣的蛋白质。这种方法提供了与免疫测定相当的定量精度，同时提供了更高的多重能力和更快的测定开发。

方法

检测开发从选择蛋白型肽开始，目标蛋白特有的肽，在质谱仪中飞行良好，并产生强烈的碎片离子。对于每个肽，在整个色谱洗脱期间监测多个转变（前体离子 m/z 到碎片离子 m/z）。 内标（通常是稳定同位素标记的目标肽）以已知浓度掺入样品中，以实现绝对定量。 Orbitrap 仪器上的平行反应监测 (PRM) 提供了一种具有高分辨率全谱采集的相关方法。 数据独立采集 (DIA) 方法（例如 SWATH-MS）通过系统地记录来自所有前体的所有碎片离子，弥合了发现和目标分析之间的差距。

实用协议

开发 SRM/MRM 检测方法首先要识别目标蛋白的蛋白肽。使用 PeptideAtlas 或 SRMAtlas 的谱库，研究人员选择长度为 7-25 个氨基酸、没有遗漏切割位点、避免蛋氨酸和色氨酸（容易氧化）的肽，并从质谱数据中产生强烈的 y 或 b 离子片段。对于每个肽，选择 3-5 个离子对 - 库谱中前 3-5 个最强的碎片离子。为每个目标合成重同位素标记的标准肽，掺入 13C/15N 标记的精氨酸或赖氨酸以产生 6-10 Da 的质量位移。根据定量策略，在消化前或消化后将重标准品以已知浓度掺入每个样品中。三重四极杆质谱仪配置有 Q1 和 Q3，分别传输前体和碎片 m/z 值，而 Q2 以针对每次跃迁的优化碰撞能量执行碰撞诱导碎片。预定的 SRM 在 2-3 分钟保留时间窗口内监控每次转变，从而最大限度地提高每次运行定量的肽数量。原始数据在 Skyline 中进行处理：对色谱峰进行积分，根据重内标确认保留时间，并计算轻重峰面积比。绝对浓度是根据该比率和已知的标准浓度得出的。一个真实的例子：开发了一种多重 MRM 测定法，可量化血浆中 50 种癌症相关蛋白，用于早期检测非小细胞肺癌，50 个靶标中有 35 个靶标的检测限低于 1 ng/mL。该检测方法在 500 名患者样本中得到验证，变异系数低于 15%。

应用程序

靶向蛋白质组学是验证和验证非靶向研究中发现的候选生物标志物的首选方法。它广泛用于临床研究，以量化与特定疾病相关的蛋白质组。这些测定补充了传统的 ELISA 测量，提供了基于凝胶的方法和[毛细管凝胶电泳](/guides/capillary-gel- electrophoresis) 的替代方案，并且可以进行多重分析以在单次运行中跟踪数十种蛋白质。与 HPLC 分离和质谱 检测集成可确保可靠的定量，而[蛋白质定量](/guides/ Protein-quantification.html) 测定可提供总蛋白质浓度的正交验证。