La captura por afinidad abarca un conjunto de técnicas bioquímicas que purifican o aíslan una proteína diana aprovechando una interacción de unión específica y reversible entre la diana (o una etiqueta de afinidad fusionada genéticamente) y un reactivo de captura inmovilizado. Estos métodos son la implementación práctica de los principios de la cromatografía de afinidad a escala de banco o microescala.
Flujo de Trabajo General
Todos los métodos de captura por afinidad siguen la misma secuencia de tres etapas. Unión: un lisado crudo o fluido biológico se incuba con la resina de afinidad en condiciones que favorecen la interacción específica. Lavado: la resina se lava extensamente con tampón para eliminar contaminantes no unidos y débilmente unidos mientras se preserva la interacción diana. Elución: la diana se libera mediante desplazamiento competitivo, cambio de pH o condiciones reductoras, y se recoge en forma purificada. Todo el proceso se realiza en formato batch (unión en lote), columna (flujo por gravedad o FPLC) o perlas magnéticas.
Reactivos de Captura
El reactivo de captura se inmoviliza en un soporte sólido. Los soportes comunes incluyen perlas de agarosa (Sepharose 4B, 6B), perlas magnéticas (Dynabeads, MagnaBind) y perlas de agarosa paramagnéticas. El reactivo de captura se acopla típicamente mediante aminas primarias (química de éster NHS) o grupos tiol (química de maleimida). La elección del soporte afecta la capacidad de unión, la unión inespecífica, la conveniencia del manejo magnético y la escalabilidad. Las perlas magnéticas permiten un procesamiento rápido en tubos de microcentrífuga sin columnas ni centrifugación.
Sistemas de Etiquetas de Afinidad
Las etiquetas de afinidad recombinantes son el enfoque más común. La etiqueta de polihistidina (6×His–10×His) se une a iones Ni²⁺ o Co²⁺ inmovilizados y se eluye con imidazol o pH bajo (Purificación His-tag/IMAC). La etiqueta GST (glutatión S-transferasa de 26 kDa) se une a glutatión inmovilizado y se eluye con glutatión reducido (Purificación GST-tag). La Strep-tag II (8 aminoácidos) se une a Strep-Tactin (estreptavidina modificada) y se eluye con biotina o destiobiotina (Purificación Strep-tag). La etiqueta MBP (proteína de unión a maltosa de 42 kDa) se une a resina de amilosa y se eluye con maltosa. La etiqueta FLAG (8 aminoácidos, DYKDDDDK) se une al anticuerpo monoclonal anti-FLAG y se eluye con péptido FLAG o pH bajo. Cada etiqueta tiene ventajas y desventajas en tamaño, costo, condiciones de elución y compatibilidad con aplicaciones posteriores.
Métodos de Afinidad Natural
Las proteínas nativas también pueden capturarse sin etiquetado. La captura basada en anticuerpos utiliza anticuerpos inmovilizados para inmunoprecipitar proteínas endógenas (Proteína A/G). La afinidad por lectinas captura glicoproteínas mediante interacciones carbohidrato-lectina. Los sistemas biotina-avidina explotan la interacción estreptavidina-biotina (K_d ≈ 10⁻¹⁴ M) para captura de ultra alta afinidad (sistemas biotina-avidina).
Aplicaciones
Los métodos de captura por afinidad purifican proteínas recombinantes para estudios estructurales y funcionales, aíslan complejos proteicos para mapeo de interacciones (purificación por afinidad–espectrometría de masas, AP-MS), enriquecen proteínas modificadas postraduccionalmente y agotan proteínas abundantes de muestras clínicas. La elección del método depende de la pureza, rendimiento, escala, costo y aplicación posteriores requeridos.
