La ultracentrifugación analítica (AUC, por sus siglas en inglés) es una técnica biofísica que caracteriza macromoléculas en solución por su comportamiento de sedimentación bajo alta fuerza centrífuga. Determina el peso molecular, la forma hidrodinámica, la estequiometría de unión y las constantes de equilibrio sin requerir estándares ni calibración de columna.
Se realizan dos experimentos complementarios. La velocidad de sedimentación centrifuga las muestras a alta velocidad y monitorea el movimiento radial del límite a medida que las moléculas sedimentan. El equilibrio de sedimentación utiliza velocidades más bajas donde la sedimentación se equilibra con la difusión, produciendo un gradiente de concentración exponencial en equilibrio.
La AUC de velocidad de sedimentación proporciona la distribución del coeficiente de sedimentación. El coeficiente de sedimentación depende de la masa molecular y del coeficiente de fricción. El coeficiente de fricción informa sobre la forma molecular. El coeficiente de difusión se obtiene del ensanchamiento del límite. La ecuación de Svedberg relaciona estos parámetros. El análisis utilizando la distribución continua c(s) en programas como SEDFIT tiene en cuenta los coeficientes de sedimentación desconvolucionados de difusión.
La AUC de equilibrio de sedimentación proporciona el peso molecular independientemente de la forma. El gradiente de concentración de equilibrio sigue una función exponencial de la posición radial. Para una especie ideal única, el peso molecular se determina a partir de la pendiente del gráfico ln c versus r. El análisis de múltiples componentes resuelve mezclas y determina constantes de asociación para sistemas que interactúan.
Los sistemas de detección incluyen óptica de absorbancia, óptica de interferencia Rayleigh y detección de fluorescencia. La detección de absorbancia es específica de longitud de onda y adecuada para muestras cromofóricas. La detección de interferencia mide cambios de concentración para todos los solutos y es más sensible. La detección de fluorescencia alcanza sensibilidad de molécula única para muestras marcadas.
Las aplicaciones de AUC incluyen la caracterización de oligomerización de proteínas, agregación de anticuerpos, interacciones proteína-ácido nucleico, heterogeneidad de lipoproteínas y distribución de tamaño de nanopartículas. La técnica no requiere marcaje y opera en condiciones de solución nativas. Se considera el estándar de oro para determinar las propiedades hidrodinámicas de macromoléculas.
Los requisitos de muestra incluyen transparencia óptica, densidad y viscosidad de tampón apropiadas, y concentración suficiente para la detección. Las concentraciones típicas varían de 0.1 a 10 mg/mL para detección de absorbancia.
