La apoptosis es un proceso regulado y dependiente de energía de muerte celular caracterizado por cambios bioquímicos y morfológicos distintos. Ningún ensayo único captura todos los aspectos, la mayoría de los experimentos usan una combinación de métodos dirigidos a diferentes características.
Ensayos de Actividad de Caspasas
Las caspasas son proteasas de cisteína-aspártico que ejecutan el programa apoptótico. La caspasa-3 y -7 son las caspasas ejecutoras principales.
Sustratos fluorogénicos: una secuencia peptídica de reconocimiento (DEVD para caspasa-3/7) unida a un fluoróforo (AMC, AFC). La caspasa activa escinde el péptido, liberando el fluoróforo. La fluorescencia (ex/em 355/460 nm para AMC) se mide en un lector de placas. El ensayo es simple, cuantitativo y adecuado para cribado de alto rendimiento.
Reporteros FRET: células que expresan un péptido DEVD flanqueado por un par de proteínas fluorescentes (p. ej., CFP–DEVD–YFP) cambian de FRET a emisión donante tras la escisión por caspasa. Estos reporteros permiten el monitoreo en tiempo real de la apoptosis en células vivas mediante microscopía o citometría de flujo.
Anexina V / Yoduro de Propidio
En la apoptosis temprana, la fosfatidilserina (PS) se transloca de la hoja interna a la externa de la membrana plasmática. La anexina V se une a PS con alta afinidad de manera dependiente de Ca²⁺. Conjugada a FITC, PE o APC, marca células apoptóticas tempranas.
El yoduro de propidio (PI) es un colorante de ADN impermeable a la membrana que entra solo cuando la membrana celular está comprometida (apoptosis tardía o necrosis). La doble tinción distingue:
- Viables: Anexina V⁻/PI⁻
- Apoptóticas tempranas: Anexina V⁺/PI⁻
- Apoptóticas tardías: Anexina V⁺/PI⁺
- Necróticas: Anexina V⁻/PI⁺
El análisis se realiza por citometría de flujo o microscopía de fluorescencia. El ensayo debe realizarse dentro de los 30 minutos posteriores a la adición de PI, ya que el PI se filtra de las células con el tiempo.
Fragmentación del ADN
Durante la apoptosis, las endonucleasas (CAD/DFF40) escinden el ADN entre nucleosomas, produciendo fragmentos en múltiplos de 180–200 pb.
Escalera de ADN: el ADN genómico se extrae, se separa en un gel de agarosa y se tiñe con bromuro de etidio. Las células apoptóticas muestran un patrón de escalera característico de fragmentos de 180 pb. Es un ensayo cualitativo de punto final y relativamente insensible, requiere ~10⁶ células.
TUNEL: la TdT incorpora dUTP marcado en los extremos 3’-OH del ADN fragmentado. La marca (biotina, DIG o fluoróforo) se detecta por microscopía o citometría de flujo. TUNEL marca todas las roturas de ADN, incluyendo las de células necróticas, por lo que se combina mejor con una discriminación basada en morfología.
Potencial de Membrana Mitocondrial
La pérdida del potencial de membrana mitocondrial (ΔΨₘ) es una característica de la vía intrínseca de apoptosis. Se usan fluoróforos que se acumulan en las mitocondrias según su potencial de membrana:
- JC-1: emite verde (monómero) a bajo ΔΨₘ y rojo (agregados J) a alto ΔΨₘ. La relación rojo/verde indica la polarización mitocondrial.
- TMRE / TMRM: colorantes cargados positivamente que se acumulan en mitocondrias polarizadas. La pérdida de fluorescencia roja indica despolarización.
Los Controles Adecuados
Todos los ensayos de apoptosis requieren controles positivos (p. ej., 1 µM estaurosporina durante 4–6 horas) y negativos (no tratados). El tiempo del ensayo es importante: la actividad de caspasa alcanza su punto máximo a las 4–8 horas, la exposición de PS a las 6–12 horas y la fragmentación del ADN a las 12–24 horas después del estímulo apoptótico.
