Ensayos de Apoptosis
La apoptosis (muerte celular programada) se caracteriza por cambios morfológicos y bioquímicos específicos. Varios ensayos complementarios distinguen la apoptosis de la necrosis e identifican la etapa de muerte celular.
Tinción con Anexina V / Yoduro de Propidio es el ensayo de apoptosis basado en citometría de flujo más común. Durante la apoptosis temprana, la fosfatidilserina (PS) se transloca de la capa interna a la externa de la membrana plasmática. La anexina V, una proteína de unión a PS conjugada a un fluoróforo (FITC, APC, PE), se une a la PS expuesta. El yoduro de propidio (PI) o 7-AAD solo entra en células con membranas comprometidas (apoptosis tardía/necrosis).
- Anexina V⁻ / PI⁻: células vivas
- Anexina V⁺ / PI⁻: células en apoptosis temprana
- Anexina V⁺ / PI⁺: células en apoptosis tardía / necrosis
Ensayo TUNEL (terminal deoxynucleotidyl transferase dUTP nick end labeling) detecta fragmentación del ADN, un marcador de apoptosis tardía. La desoxinucleotidil transferasa terminal (TdT) añade dUTP marcado a los extremos 3′-OH del ADN fragmentado. La detección es por microscopía de fluorescencia o citometría de flujo.
Ensayos de caspasa miden la actividad de las caspasas, las proteasas ejecutoras de la apoptosis. Sustratos fluorogénicos (ej., DEVD-AMC para caspasa-3/7) son escindidos por caspasas activas, liberando una señal fluorescente. La actividad de caspasa-3/7 es el marcador bioquímico de apoptosis más utilizado.
Análisis del Ciclo Celular
El análisis del ciclo celular mide la distribución de células en las fases G₀/G₁, S, G₂ y M, revelando los efectos de fármacos, nutrientes o cambios genéticos en la división celular.
Análisis de contenido de ADN por citometría de flujo utiliza un colorante fluorescente de unión a ADN (PI, DAPI, Hoechst 33342). Las células fijadas y permeabilizadas se tiñen y se mide la intensidad de fluorescencia. La intensidad es proporcional al contenido de ADN:
- G₀/G₁: contenido de ADN 2N (un pico)
- S: entre 2N y 4N (la región entre picos)
- G₂/M: contenido de ADN 4N (segundo pico)
El porcentaje de células en cada fase se calcula usando software de modelado (ModFit, algoritmo Watson de FlowJo).
Pulso-caza con BrdU/EdU proporciona información más detallada del ciclo celular. Un pulso corto de BrdU o EdU marca las células en fase S. Después de un período de caza, las células se analizan tanto para contenido de ADN como para incorporación de BrdU/EdU, revelando la tasa de progresión en fase S y la duración de cada fase.
Tinción de fosfo-histona H3 (Ser10) marca específicamente células mitóticas, proporcionando un marcador de fase G₂/M que distingue G₂ de M por citometría de flujo o microscopía.
