Después de aislar un cultivo puro, el siguiente paso es la identificación. Las pruebas bioquímicas tradicionales evalúan las capacidades metabólicas, mientras que los sistemas automatizados modernos aceleran y estandarizan el proceso.

Pruebas Bioquímicas Fundamentales

• Catalasa: detecta la enzima catalasa, que descompone el peróxido de hidrógeno. Una gota de H₂O₂ al 3% sobre una colonia produce burbujas (positivo) en segundos. Los estafilococos son catalasa-positivos; los estreptococos son catalasa-negativos.
• Oxidasa: detecta citocromo c oxidasa. Una colonia untada en papel de filtro impregnado con reactivo de oxidasa (tetrametil-p-fenilendiamina) se vuelve púrpura oscuro en 10–30 segundos (positivo). Neisseria y Pseudomonas son oxidasa-positivos; Enterobacteriaceae son oxidasa-negativos.
• Coagulasa: distingue Staphylococcus aureus (positivo) de otros estafilococos. La coagulasa libre se detecta mezclando una colonia con plasma de conejo y verificando la formación de coágulo a las 4–24 horas.
• Indol: algunas bacterias (E. coli entre otras) producen indol a partir de triptófano. El indol reacciona con el reactivo de Kovac (p-dimetilaminobenzaldehído) para producir una capa roja.
• Rojo de metilo / Voges-Proskauer (MR/VP): MR detecta fermentación ácida mixta (rojo con indicador rojo de metilo). VP detecta la ruta de fermentación del butanodiol (rosa/rojo con α-naftol y KOH). Clásico para E. coli (MR⁺, VP⁻) vs. Enterobacter / Klebsiella (MR⁻, VP⁺).
• Utilización de citrato: las bacterias que usan citrato como única fuente de carbono producen amoníaco, elevando el pH y cambiando el azul de bromotimol de verde a azul. Klebsiella pneumoniae es positiva; E. coli es negativa.
• Agar TSI (Triple Sugar Iron): un slant que detecta fermentación de glucosa, lactosa y sacarosa, producción de gas y producción de H₂S. El patrón de reacciones ácido/alcalino y precipitado negro es distintivo para bacterias entéricas.

Sistemas Miniaturizados (Tiras API)

El sistema API (Analytical Profile Index) miniaturiza 20–50 pruebas bioquímicas en una tira de plástico. Cada prueba es un sustrato deshidratado en una cúpula. La tira se inocula con una suspensión bacteriana estandarizada, se incuba durante 18–24 horas, y las reacciones se leen según los cambios de color. El número de perfil de 7 o 9 dígitos resultante se busca en una base de datos para identificar el organismo.

Sistemas Automatizados

• VITEK (bioMérieux): utiliza tarjetas de plástico que contienen 30–60 reacciones bioquímicas. Una suspensión bacteriana se carga en la tarjeta, que se sella y se lee automáticamente cada 15 minutos. La identificación se genera en 2–8 horas. VITEK 2 también proporciona pruebas de sensibilidad antimicrobiana (AST).
• MALDI-TOF MS (Espectrometría de Masas con Desorción/Ionización Láser Asistida por Matriz con Analizador de Tiempo de Vuelo): el método de identificación más rápido disponible. Una colonia bacteriana se coloca en una placa diana, se cubre con una matriz (ácido α-ciano-4-hidroxicinámico) y se analiza por espectrometría de masas. El espectro de proteínas resultante (principalmente proteínas ribosómicas) se compara con una base de datos, proporcionando identificación a nivel de especie en menos de un minuto por muestra.

MALDI-TOF ha reemplazado en gran medida las pruebas bioquímicas en los laboratorios de microbiología clínica debido a su velocidad, precisión y bajo costo de consumibles después de la adquisición del instrumento. Identifica bacterias, levaduras y hongos a partir de una sola colonia sin requerir conocimiento previo del organismo.