La transformación es la captación y replicación de ADN extraño por células bacterianas. La mayoría de las cepas de laboratorio de Escherichia coli no son naturalmente competentes — deben ser inducidas artificialmente para captar ADN.

Preparación de Células Competentes

Células químicamente competentes se preparan lavando E. coli en fase logarítmica con CaCl₂ helado (50–100 mM). Los iones de calcio neutralizan la carga negativa del esqueleto de fosfato del ADN y la capa de lipopolisacáridos de la membrana externa bacteriana, facilitando la unión del ADN. Las células se alícuotan y se congelan a −80 °C.

Células electrocompetentes se lavan repetidamente en glicerol al 10% helado para eliminar todos los iones de la suspensión. La baja fuerza iónica evita la formación de arcos durante la electroporación. Las células se resuspenden en un volumen pequeño de glicerol al 10%, se alícuotan y se congelan.

Protocolo de Transformación Química

1. Descongelar un tubo de células químicamente competentes en hielo (aproximadamente 20 minutos).
2. Añadir 1–10 µL de ADN (0.1–100 ng de plásmido, o hasta 5 µL de una reacción de ligación).
3. Incubar en hielo durante 20–30 minutos.
4. Choque térmico a 42 °C durante exactamente 45 segundos — más tiempo reduce la viabilidad.
5. Volver a hielo durante 2 minutos.
6. Añadir 500–900 µL de medio SOC o LB (sin antibiótico).
7. Incubar a 37 °C con agitación a 200–225 rpm durante 45–60 minutos.
8. Sembrar 50–200 µL en placas de agar selectivo.
9. Incubar invertidas durante la noche a 37 °C.

Eficiencia típica: 10⁶–10⁸ UFC/µg para células químicamente competentes.

Protocolo de Electroporación

1. Descongelar células electrocompetentes en hielo.
2. Transferir las células a una cubeta fría de 0.1 o 0.2 cm.
3. Añadir 1–2 µL de ADN en tampón de baja salinidad o agua (la sal causa arcos).
4. Electroporar a 1.5–2.5 kV (según la separación de la cubeta), 200–400 Ω, 25 µF.
5. Añadir inmediatamente 500 µL de medio SOC y resuspender.
6. Transferir a un tubo de cultivo e incubar a 37 °C durante 45–60 minutos.
7. Sembrar en agar selectivo.

Eficiencia típica: 10⁹–10¹⁰ UFC/µg para plásmidos pequeños. La electroporación se prefiere para construcciones grandes (>10 kb) y productos de ligación.

Selección

Las células transformadas se seleccionan en agar que contiene un antibiótico que coincide con el marcador de resistencia en el plásmido. Antibióticos comunes: ampicilina (100 µg/mL), kanamicina (50 µg/mL), cloranfenicol (25 µg/mL), tetraciclina (12.5 µg/mL). La selección con ampicilina requiere placas frescas porque la β-lactamasa se difunde y degrada el antibiótico — aparecen colonias satélite en placas viejas.