La metilación del ADN en dinucleótidos CpG es la modificación epigenética mejor caracterizada. La conversión con bisulfito combinada con secuenciación proporciona una lectura cuantitativa de todo el genoma de esta marca.
Química del Bisulfito
El tratamiento del ADN genómico con bisulfito de sodio (NaHSO₃) a pH bajo (pH 5.0, 50–70 °C, 4–16 horas) desamina las citosinas no metiladas a uracilo, mientras que la 5-metilcitosina (5mC) y la 5-hidroximetilcitosina (5hmC) son resistentes a la desaminación. Después de la amplificación por PCR, el uracilo se lee como timina y la 5mC como citosina.
La tasa de conversión debe ser >99% para ser confiable. A menudo se usa un control de ADN de fago lambda no convertido para medir la eficiencia de conversión.
Métodos
Secuenciación genómica completa con bisulfito (WGBS): secuenciación de todo el genoma después de la conversión con bisulfito. Es el estándar de oro para el análisis completo de metilación con resolución de base única en todo el genoma. Los costos computacionales son altos: una cobertura de 30× requiere ~900 millones de lecturas para el genoma humano. Como el ADN convertido con bisulfito es en gran parte C→T (y G→A en la cadena complementaria), la alineación requiere un índice de genoma de tres letras especializado (C→T convertido en ambas cadenas).
Secuenciación con bisulfito de representación reducida (RRBS): el ADN genómico primero se digiere con una enzima de restricción insensible a metilación (MspI, C↓CGG), que corta en regiones ricas en CpG. Los fragmentos se seleccionan por tamaño (40–220 pb), se convierten con bisulfito y se secuencian. RRBS enriquece para islas CpG, promotores y otras regiones reguladoras a ~10–20% del costo de WGBS.
Secuenciación dirigida con bisulfito: se diseñan cebadores de PCR para amplificar regiones específicas de interés a partir de ADN convertido con bisulfito. El producto de PCR se secuencia por Sanger o NGS. Hay paneles multiplexados dirigidos que cubren cientos de regiones disponibles comercialmente. Este enfoque es rentable para proyectos centrados en paneles de genes específicos.
Pirosencuenciación: un método cuantitativo de secuenciación en tiempo real para amplicones cortos (100–200 pb) de ADN convertido con bisulfito. La altura del pico en cada posición C refleja la proporción de C (metilada) a T (no metilada), dando un porcentaje de metilación cuantitativo en cada sitio CpG. La pirosencuenciación es el estándar de oro para la validación de marcas de metilación identificadas por matriz o NGS.
Análisis de Datos
La metilación en cada CpG se reporta como un valor β: β = M / (M + U + 100), donde M son lecturas metiladas y U no metiladas. Los valores β van de 0 (completamente no metilado) a 1 (completamente metilado).
El análisis de metilación diferencial identifica posiciones (DMP) y regiones (DMR) diferencialmente metiladas entre condiciones. La mayoría de los métodos usan un modelo beta-binomial para tener en cuenta la cobertura variable en los sitios CpG.
Distinción entre 5mC y 5hmC
La secuenciación con bisulfito estándar no puede distinguir 5-metilcitosina de 5-hidroximetilcitosina, ambas están protegidas de la desaminación. Para detectar específicamente 5hmC, se requieren métodos adicionales:
- TAB-Seq: la T4-β-glucosiltransferasa protege 5hmC con glucosa, luego TET1 oxida 5mC a 5caC, que luego se convierte a uracilo por bisulfito. Solo 5hmC se lee como C.
- oxBS-Seq: el perrutenato de potasio (KRuO₄) oxida 5hmC a 5fC, que se convierte a uracilo por bisulfito. 5mC permanece como C. Comparando oxBS-Seq con BS-Seq estándar se obtiene el nivel de 5hmC por sustracción.
