La electroforesis de zona capilar (CZE) es la modalidad más fundamental y ampliamente utilizada de la electroforesis capilar. En CZE, el capilar se llena con un electrolito de fondo (BGE) continuo y uniforme, y la muestra se introduce como un tapón estrecho en el extremo de entrada. Bajo la influencia del campo eléctrico aplicado, cada analito migra con su velocidad característica, determinada por la suma de su movilidad electroforética y el flujo electroosmótico (EOF). Los analitos que difieren en carga o tamaño migran a diferentes velocidades y se resuelven en zonas discretas a medida que viajan hacia el detector. La CZE se aplica en una amplia gama de clases de analitos, desde pequeños iones inorgánicos y productos farmacéuticos hasta péptidos, proteínas y fragmentos de ácidos nucleicos.
El Mecanismo de Separación por Zonas
La velocidad neta de migración de un analito en CZE es la suma vectorial de su velocidad electroforética (hacia el electrodo de carga opuesta) y la velocidad electroosmótica (normalmente hacia el cátodo). A pH superior a 3, el EOF es generalmente más fuerte que la movilidad electroforética de la mayoría de los aniones, por lo que todos los analitos — cationes, neutros y aniones — son arrastrados hacia el detector en el extremo del cátodo. Los cationes migran más rápido porque su migración electroforética va en la misma dirección que el EOF. Los analitos neutros migran a la velocidad del EOF y co-eluyen como un solo pico no resuelto, por lo que la CZE no es adecuada para especies neutras sin modificación. Los aniones migran más lentamente porque su migración electroforética se opone al EOF, y aquellos con movilidades mayores que el EOF en la dirección opuesta nunca alcanzan el detector. La ventana de separación se define por el tiempo de migración de un marcador neutro (t_EOF) y el tiempo en que emerge el anión más lento.
Composición del Tampón y Selectividad
La elección del BGE es la herramienta más poderosa para controlar la selectividad en CZE. El pH del tampón determina el estado de ionización de los analitos ácidos y básicos y, por lo tanto, su carga efectiva y movilidad. Para separaciones de péptidos y proteínas, el pH se ajusta a un valor donde las especies de interés tienen cargas netas significativamente diferentes, típicamente en el rango de 2 a 9. La fuerza iónica del tampón afecta tanto la magnitud del EOF como el grosor de la doble capa eléctrica; una mayor fuerza iónica reduce el EOF y comprime la doble capa, mejorando la resolución pero aumentando la corriente y el calentamiento Joule. Se pueden agregar solventes orgánicos como acetonitrilo o metanol al BGE para alterar la solubilidad de los analitos, cambiar la constante dieléctrica y modificar el EOF. Las separaciones quirales se logran agregando ciclodextrinas u otros selectores quirales al BGE, que forman complejos diastereoméricos transitorios con enantiómeros.
Platos Teóricos y Resolución
Las separaciones por CZE se caracterizan por números de platos extremadamente altos, que a menudo superan los 200,000 platos por metro. El ensanchamiento de zona en CZE está dominado por la difusión longitudinal, porque el perfil plano del EOF elimina el ensanchamiento inducido por el flujo que limita la eficiencia de la HPLC. El número de platos teóricos (N) viene dado por N = (µ_app V) / (2 D), donde µ_app es la movilidad aparente, V es el voltaje aplicado y D es el coeficiente de difusión. La resolución entre dos picos depende de la diferencia en sus movilidades aparentes, el número promedio de platos y la velocidad electroosmótica. La resolución se puede mejorar aumentando el voltaje aplicado (hasta el límite del calentamiento Joule), extendiendo la longitud efectiva del capilar, reduciendo el EOF (disminuyendo el pH o usando capilares recubiertos) u optimizando la composición del tampón para maximizar la diferencia de movilidad entre los analitos.
Apilamiento de Muestra para Mayor Sensibilidad
La sensibilidad de concentración de la CZE con detección de absorbancia UV está limitada por la corta longitud de la trayectoria óptica y el pequeño volumen de inyección (típicamente 1 a 20 nL). Las técnicas de preconcentración en el capilar, conocidas colectivamente como apilamiento (stacking), mejoran dramáticamente la sensibilidad al concentrar la zona de la muestra antes de que comience la separación. El apilamiento de muestra amplificado por campo (FASS) aprovecha la diferencia de conductividad entre la matriz de la muestra (baja conductividad) y el BGE (alta conductividad). Cuando se aplica voltaje, el campo eléctrico más alto en la zona de muestra de baja conductividad hace que los iones del analito migren rápidamente hasta que alcanzan el límite del BGE, donde se ralentizan y se acumulan en una banda estrecha. El barrido (sweeping) utiliza fases pseudoestacionarias como micelas para capturar y enfocar analitos neutros o cargados. La isotacoforesis transitoria (tITP) emplea un sistema de electrolito principal y terminador para enfocar los analitos en zonas nítidas, similar a la isotacoforesis capilar, antes de pasar a la separación por CZE. Estos métodos de apilamiento pueden proporcionar una mejora de sensibilidad de 10 a 1000 veces, llevando los límites de detección UV al rango nanomolar bajo.
Aplicaciones en el Laboratorio Clínico
La CZE se utiliza ampliamente en laboratorios clínicos para el análisis de proteínas séricas, donde ha reemplazado en gran medida a la electroforesis en gel de agarosa para la electroforesis de proteínas séricas (SPEP) de rutina. Las proteínas séricas se separan en cinco fracciones principales — albúmina, alfa-1, alfa-2, beta y gamma globulinas — y el electroferograma se evalúa para detectar gammapatías monoclonales, patrones inflamatorios y deficiencias proteicas. La CZE también es el método de elección para el cribado de hemoglobinopatías, separando variantes de hemoglobina como HbA, HbF, HbS y HbC a pH alcalino. En el análisis farmacéutico, la CZE se utiliza para pruebas de pureza de fármacos, determinación de contraiones y perfilado de impurezas quirales. En proteómica, la CZE acoplada con espectrometría de masas (CZE-MS/MS) proporciona una separación de péptidos de alta eficiencia para la identificación de proteínas bottom-up, particularmente ventajosa para muestras de bajo volumen y péptidos básicos que son difíciles para la LC-MS en fase reversa.
Consideraciones de Desarrollo de Métodos
El desarrollo de un método CZE comienza con la selección del pH del BGE basado en los valores pKa de los analitos. Un tampón de fosfato o borato a pH 2.5 es un punto de partida común para moléculas pequeñas y péptidos. Las dimensiones del capilar (longitud, diámetro interno) y el voltaje aplicado se eligen para equilibrar la velocidad de análisis con la resolución. La temperatura de la columna se controla mediante enfriamiento por aire forzado o líquido para disipar el calor Joule, y el capilar se enjuaga entre corridas con hidróxido de sodio, agua y BGE para mantener la reproducibilidad. Para el análisis cuantitativo, se agrega un estándar interno para corregir la variabilidad del volumen de inyección, y el método se valida para linealidad, precisión, exactitud y robustez según las directrices ICH.
